簡化低溫放熱法用于葡萄葉片耐霜凍能力評價

孫魯龍 ，丁家寧，翟 衡，杜遠(yuǎn)鵬※

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，泰安271018； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室?西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，楊凌 712100； 3.陜西省蘋果工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100）

0 引 言

低溫脅迫對葡萄的生長和品種區(qū)域化都具有重要的影響[1-4]。葡萄在年生長周期中容易遭受的低溫脅迫主要有休眠季凍害以及生長季霜凍害2 種。相對于休眠季凍害，生長季霜凍害對葡萄的影響更大。2015 年11 月23—24 日, 山東省發(fā)生了大范圍突發(fā)性霜凍天氣, 許多葡萄種植區(qū)遭受了前所未有的損失。山東省以濟(jì)寧地區(qū)受害最為嚴(yán)重, 上千畝葡萄在未落葉之前遭遇強低溫, 致使葡萄葉片、枝條甚至是果實嚴(yán)重受凍, 造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2017 年4 月份，席卷歐洲的霜凍導(dǎo)致歐盟葡萄產(chǎn)量為36 a 來歷史最低。有研究表明，隨著全球氣候變化的加劇，霜凍對果樹栽培所構(gòu)成的威脅越來越大[5]。1

抗霜凍品種的選育與應(yīng)用是提高葡萄抗霜能力的根本途徑，而在開展育種工作之前需要對種質(zhì)資源的抗霜凍能力進(jìn)行評價。目前國內(nèi)外在植物抗霜凍能力的鑒定方面還不成熟，這主要體現(xiàn)在評價植物耐霜凍能力的指標(biāo)不健全上。常用的抗寒性鑒定指標(biāo)主要有組織褐變等形態(tài)指標(biāo)[6]，半致死溫度等溫度指標(biāo)[7]，以及其他生理、生化指標(biāo)[8-11]。從理論上講這些指標(biāo)都能反映植物的抗霜凍能力，但不同指標(biāo)的獲取方法往往會限制其在植物耐霜凍評價中的應(yīng)用。比如大多數(shù)的生理、生化指標(biāo)，其測定過程往往是損傷性的。此外為了解生理、生化參數(shù)隨時間的變化，就需要在霜凍處理過程中連續(xù)取樣，不僅耗時還會造成取樣期間測定系統(tǒng)中溫度的變化，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此如何在不影響霜凍處理過程的情況下獲得更多可靠的信息以評價植物耐霜凍能力是值得探索的問題。

低溫放熱分析(low temperature exotherms，LTE)是一種通過連續(xù)監(jiān)測、記錄低溫環(huán)境下組織放熱過程，并提取有效信息用于評定植物組織抗寒性的一種技術(shù)[12-13]。低溫放熱法除能獲得反映植物組織抗寒性的常規(guī)指標(biāo)（如半致死溫度，LT50）外，還能提供更為豐富的信息。Gu[14]采用低溫放熱法不僅測出了休眠季葡萄冬芽的半致死溫度，同時還提出了當(dāng)材料的半致死溫度（LT50）相同時，以20%~80%材料致死期間的擬合直線斜率（QLT）作為補充參數(shù)，用于比較材料對低溫的敏感性。高振等[15-17]在分析葡萄根系、枝條的低溫放熱曲線時發(fā)現(xiàn)，葡萄根系、枝條的低溫放熱曲線存在2 條突變高峰，并進(jìn)一步揭示了其與韌皮部、木質(zhì)部抗寒性的關(guān)系。

雖然低溫放熱法在葡萄抗寒性鑒定中發(fā)揮了重要的作用，但是到目前為止，該方法主要用于休眠季根系、芽 和枝條的抗寒性鑒定，在生長季葉片抗寒性的鑒定中并未得到有效應(yīng)用。此外，傳統(tǒng)的低溫放熱法需要的硬件系統(tǒng)比較多，操作繁瑣，難以實現(xiàn)大量、快速、高效的測定。本研究采用開發(fā)的多點測溫系統(tǒng)對傳統(tǒng)低溫放熱法進(jìn)行簡化以適應(yīng)葉片耐霜凍能力評價的應(yīng)用需求，同時比較不同葡萄品種葉片在春季的耐霜凍能力，以期為評價葡萄葉片耐霜凍能力提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗品種及樣品采集

試驗所用的品種有5 a 生玫瑰香、赤霞珠、雷司令、小芒森、美樂、霞多麗、巨峰、夏黑、摩爾多瓦、威代爾、Becker hance、Frontenac、SO4、140Ru；2 a 生華葡（表1）。所有植株南北行向種植, 株、行距2 m×3 m。除夏黑、摩爾多瓦為棚架栽培外, 其他品種均為籬架栽培, 單干雙臂整形。

采樣及試驗時間為2016 年5 月20—30 日， 每次采樣時間均為早上08:00—09:00 之間。采樣時將新梢梢尖下第1 片展開葉連同葉柄采下。為了防止葉片失水，樣品采下后立即放在自封袋中，做好標(biāo)記置于冰盒內(nèi)保鮮，盡快帶回實驗室用于試驗，或暫時保存于4℃冰箱內(nèi)備用，一次采集的樣品在24 h 之內(nèi)用于試驗。

表1 試驗品種 Table 1 Cultivars used in study

1.2 低溫處理

采用高低溫濕熱測試箱(蘇州智何環(huán)境試驗設(shè)備有限公司)對材料進(jìn)行低溫處理，降溫程序設(shè)置為：10 min 內(nèi)從室溫勻速降到4 ℃，30 min 內(nèi)從4 ℃勻速下降到-10 ℃。低溫處理期間，利用與北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心聯(lián)合開發(fā)的多點測溫系統(tǒng)檢測葉片溫度的變化。多點測溫系統(tǒng)有9 個樣品槽，每個樣品槽的中心固定1 個溫敏傳感器（精度為±0.001 ℃），每秒記錄1 次溫度，同時可以將樣品槽的溫度及時傳到主機上，并以實時曲線的形式顯示。試驗時，將9 個樣品槽按“九宮格”形式緊密排列，最中間的1 個樣品槽中不放樣品用于監(jiān)測氣溫，其余8 個設(shè)置樣品。設(shè)置樣品時，將葉片緊貼在樣品槽中的溫度探頭上，葉片上部覆蓋一層鋁箔紙以防止葉片失水并保持葉片與外界良好的熱量交換。每1 個品種重復(fù)21 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理及評價方法

利用Excel 2013 進(jìn)行簡單數(shù)據(jù)計算，采用Origin 9.0繪制葡萄葉片溫度隨氣溫降低的變化規(guī)律圖，采用SPSS 21.0 進(jìn)行相關(guān)性分析、單因素方差分析（多重比較采用LSD 法）和聚類分析（歐氏距離最長距離法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片典型低溫放熱曲線

在低溫處理過程中，葉片表面溫度呈現(xiàn)規(guī)律性變化（圖1）。以低溫處理‘140Ru’葉片為例，隨著環(huán)境溫度的降低，葉片表面的溫度也以近似相同的速率逐漸降低，說明此階段葉片表面溫度主要受周圍環(huán)境影響。當(dāng)環(huán)境溫度降至一定程度后，葉片內(nèi)部因水分開始處于過冷卻狀態(tài)，導(dǎo)致葉片表面溫度不再隨環(huán)境溫度的降低而降低，而是在一定的低溫水平（過冷點，T1）維持一段時間t1, 隨著溫度降低，葉片內(nèi)部水分的過冷卻狀態(tài)被打破，水分凝結(jié)并釋放出大量熱量，導(dǎo)致葉片溫度從T1迅速升高到最高水平（冰點，T2），從T1到T2所需的時間為t2。隨著環(huán)境溫度的進(jìn)一步降低，因水分凝結(jié)而釋放的熱量被周圍環(huán)境吸收，導(dǎo)致葉片溫度在T2維持一段時間t3后逐漸下降，并最終與環(huán)境溫度趨于一致，從葉片溫度達(dá)到T1到葉片溫度的變化與氣溫變化一致期間，葉片溫度曲線與氣溫基線構(gòu)成形狀的面積為S。不同品種在同一降溫條件下獲得的典型參數(shù)如表2 所示。

圖1 葡萄葉片溫度隨氣溫降低的變化 Figure1 Variety of grapevine leaf temperature as air temperature dropped down

表2 15 個葡萄品種葉片低溫放熱曲線參數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差） Table 2 Parameters of LTE curves in leaves of 15 grapevine cultivars （Means±SD）

2.2 不同品種低溫放熱曲線參數(shù)方差分析

為篩選出可用于評價不同葡萄品種葉片抗霜凍能力的低溫放熱曲線參數(shù)，將15 個品種的6 組低溫放熱曲線參數(shù)首先進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的參數(shù)之間的相關(guān)性存在較大差異。T1和T2、S 在0.01 水平上顯著正相關(guān)；T2與t3在0.05 水平上顯著正相關(guān)，與S 在0.01 水平上顯著正相關(guān)；t2和t3在0.05 水平上顯著正相關(guān)，其他參數(shù)之間正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（表 3）。說明從葡萄葉片低溫放熱曲線上提取的參數(shù)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，可以采用降維處理的方法簡化變量用于后期綜合評定葉片的抗霜凍能力。

表3 各參數(shù)的相關(guān)系數(shù) Table 3 Correlation coefficient matrix of parameters

單因素方差分析結(jié)果顯示（表 4），不同品種的T2、t2和S 存在顯著性差異，因此可以單獨用于區(qū)別和評價不同葡萄葉片耐霜凍能力，T1、t1和t3不具有顯著性差異，說明這3 個指標(biāo)不能區(qū)別葡萄葉片的抗霜凍能力。

2.3 低溫放熱曲線有效參數(shù)的隸屬函數(shù)分析

采用單一指標(biāo)評價葡萄葉片的抗霜凍能力可能存在片面性，因此本研究采用隸屬函數(shù)法，結(jié)合T2、t2和S 的評價結(jié)果對15 個品種葉片的耐凍能力進(jìn)行綜合評定。參考高振的方法[16], 對不同葡萄品種的T2、t2和S 分別計算隸屬函數(shù)值, 并求出隸屬函數(shù)值的平均值以反映葉片的綜合抗霜凍能力(表5)。從表5 可以看出, 不同品種的隸屬函數(shù)值差異比較大,其中夏黑的最高(為0.865); 玫瑰香的最低(為0.096)，說明不同葡萄品種葉片的抗霜凍能力差異較大。對15 個品種的平均隸屬函數(shù)值采用最短距離 法聚類(圖2), 結(jié)果顯示15 個品種葉片的耐凍能力可以劃分為3 類: I: 玫瑰香和Frontenac, 平均隸屬函數(shù)值為0.113; II: 夏黑，平均隸屬函數(shù)值為0.865; III: 其他品種, 平均隸屬函數(shù)值為0.487。由于T2、t2和S 之間存在正相關(guān)關(guān)系，而一般認(rèn)為冰點T2越小，組織器官的抗寒性越好，因此T2、t2和S 三者的隸屬函數(shù)值越小抗凍能力越好。綜合判斷，在所選擇的15 個葡萄品種中，玫瑰香和Frontenac 的抗霜凍能力最好，夏黑的抗霜凍能力最差，其他品種的抗霜凍能力介于二者之間。

表4 低溫放熱曲線參數(shù)單因素方差分析結(jié)果 Table 4 Univariate analysis of parameters derived from LTE curves

表5 15 個葡萄品種葉片的抗寒性隸屬函數(shù)分析 Table 5 Affiliation function analysis of cold hardiness in leaves of 15 grapevine cultivars

圖 2 根據(jù)隸屬函數(shù)值對15 個葡萄品種葉片抗凍能力聚類 Figure 2 Cluster analysis of cold hardiness of 15 grapevine cultivars leaves according to functional values

3 討 論

在有關(guān)葡萄抗寒鑒定的研究中，針對根系和休眠期枝干的研究較多[18-22]，但對生長季葉片耐霜凍能力的研究卻很少[23-24]。本研究在前期試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了不同葡萄種質(zhì)資源嫩葉的低溫放熱曲線，從低溫放熱的角度對葡萄葉片的耐霜凍能力進(jìn)行了綜合評價。

低溫放熱法在分析葡萄根系、休眠芽、枝干的抗寒性方面應(yīng)用比較廣泛，但在葉片方面還未見報道。本試驗通過簡化低溫放熱法，獲得了典型的葡萄葉片低溫放熱曲線。從試驗結(jié)果看，葉片的低溫放熱曲線只有一個突變高峰，這與根系、休眠芽、枝干的低溫放熱曲線存在多個放熱高峰[15-17]有顯著區(qū)別。這可能是因為相對于根系、休眠芽和枝干而言，葉片特別是新生嫩葉，組織結(jié)果較為簡單，不存在類似于根系、休眠芽和枝干那樣的多層組織分化，因此嫩葉不具備多層的水分分布，在較低溫度環(huán)境下，葉片中的水分會一次性凝結(jié)，因此在低溫放熱曲線上只顯示一個放熱高峰。

典型的葡萄葉片低溫放熱曲線上包含了很多有價值的信息，如何識別這些信息并將其與葉片的抗霜凍能力聯(lián)系起來是本研究的重點。在本研究中發(fā)現(xiàn)，葉片的低溫放熱曲線上至少存在6 個與抗寒性相關(guān)的指標(biāo)，即過冷點（T1）、過冷點維持時間（t1）、過冷點升溫到冰點的時間（t2）、冰點（T2）、冰點維持時間（t3）以及放熱曲線與氣溫基線圍成的面積（S）。這些指標(biāo)與抗寒性是否相關(guān)首先在于這些指標(biāo)能否單獨將不同的品種區(qū)別開。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，6 個參數(shù)中只有T2、t2、和S 3 個參數(shù)在品種之間存在區(qū)別，而其他參數(shù)，特別是過冷點T1在不同品種間無顯著差異。過冷現(xiàn)象是植物適應(yīng)凍害的一種重要機制，但是據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄嫩葉對霜凍低溫的適應(yīng)機制可能并不是過冷卻效應(yīng)，這與常規(guī)認(rèn)識存在較大區(qū)別，葡萄葉片響應(yīng)霜凍低溫的生理生態(tài)機制有待于進(jìn)一步深入研究。

T2、t2、和S 雖然在不同的品種之間存在顯著性的差異，但其與抗寒性的關(guān)系仍不清楚。一般而言，冰點T2可以被用于組織器官的抗寒性評價，冰點越低說明組織器官的抗凍能力越強。由此推斷，與冰點T2相關(guān)的參數(shù)也可能用于抗寒性評價。在各參數(shù)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，S 、t2與T2都存在正相關(guān)關(guān)系，因此S 、t2的值越小，組織器官的抗凍能力越強。

采用單一指標(biāo)進(jìn)行評價往往會存在片面性，為此本研究結(jié)合隸屬函數(shù)法，綜合分析了不同品種的耐霜凍能力，但其鑒定結(jié)果與采用其他方法得出的結(jié)果相比存在一定的差異[23-24]。這可能是由于不同方法所反映的信息各有側(cè)重。此外，植物抗寒性與物候期存在密切的聯(lián)系，不同的品種物候期存在差異，因此不同的品種不一定會在同一時間遭受霜凍。本研究以及前期研究所獲得的評價結(jié)果僅可作為所有品種都有嫩葉發(fā)生時遭受霜凍的參考。由于霜凍在試驗地區(qū)并不是每年都會發(fā)生，因此以大田環(huán)境下霜凍發(fā)生時不同品種抗霜凍能力的差異校正本研究結(jié)果，綜合不同技術(shù)手段建立植物抗霜凍能力鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，全面認(rèn)識葡萄葉片抗霜凍機制是下一步研究的重點。此外，在本研究中，葡萄葉片的低溫放熱曲線涉及到許多典型參數(shù)，這些參數(shù)是否與特定的生理生化過程相聯(lián)系也有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

為了從低溫放熱角度了解葡萄葉片的耐霜凍特性，鑒定不同葡萄品種葉片的耐霜凍能力，本文對15 個葡萄品種萌芽期的嫩葉進(jìn)行了人工霜凍處理，利用新開發(fā)的多點測溫系統(tǒng)獲得霜凍過程中葡萄嫩葉的低溫放熱曲線，提取有效參數(shù)，用于比較不同葡萄品種的耐霜凍能力，得出以下主要結(jié)論：

1）低溫放熱法可用于葡萄葉片耐霜凍能力評價。葉片冰點T2、過冷點升溫到冰點所需時間t2和放熱曲線與基線圍成的面積S 可單獨用于比較不同品種葉片的耐霜凍能力。

2）綜合考慮T2、t2和S 3 個指標(biāo)，可將供試葡萄品種葉片的耐霜凍能力分為3 類：Ⅰ 玫瑰香和Frontenac, 耐霜凍能力較強，平均隸屬函數(shù)值為0.113；Ⅱ 夏黑，耐霜凍能力最弱，平均隸屬函數(shù)值為0.865；Ⅲ 其他品種，耐霜凍能力介于Ⅰ、Ⅱ之間，平均隸屬函數(shù)值為0.487。