lncRNA ABHD11-AS1通過調(diào)控STAT1/STAT3表達促進非小細胞肺癌細胞增殖與遷移*

李正雄 武奮萍 鄧博云 葉海茵 劉春香 楊志雄

目前，肺癌是全球癌癥相關死亡的首要原因［1］。盡管使用CT掃描篩查能提高早期診斷率，但5年相對生存率仍然較低（18%），部分原因是由于近半數(shù)的病例就診時已經(jīng)屬于晚期，其5年生存率僅為4%［1-2］，因此迫切需要尋找有助于肺癌早期診斷或分期以及新的靶向治療標記物。越來越多的證據(jù)表明，超過70%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成初級RNA，但只有約2%編碼產(chǎn)物肽，其余為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［3-4］。這些ncRNA在其轉(zhuǎn)錄物長度上可以被分成兩組：＜200 bp的小ncRNA和≥200 bp［5］的長ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）。本研究應用qRT-PCR技術檢測非小細胞肺癌組織及細胞中l(wèi)ncRNA ABHD11-AS1的表達，并通過基因干擾技術抑制非小細胞肺癌細胞株中ABHD11-AS1的表達，觀察其在體外對非小細胞肺癌細胞增殖、克隆及遷移侵襲能力的影響，并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 樣本收集 選取2016年7月至2018年12月在廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行非小細胞肺癌手術的248例患者，中位年齡60（17～78）歲。所有病例均經(jīng)病理組織學診斷；所有標本直接取自手術切除物，均為配對組織，即癌組織和癌旁正常組織（距離病灶≥5 cm，經(jīng)病理證實無腫瘤細胞浸潤）。在手術切除后10 min之內(nèi)取材并置于凍存管中，儲存至-80℃。所有患者均獲得隨訪，采用電話隨訪形式，首次隨訪時間為2016年12月，末次隨訪時間為2019年3月，隨訪時間5～32個月。

1.1.2 試劑與儀器 RNA提取試劑盒購自北京天根生物公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國諾維贊生物公司，熒光定量PCR 試劑盒購自北京康為世紀生物公司，7500 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。所有siRNA試劑均購自北京吉碼公司。

1.1.3 qRT-PCR檢測基因lncRNA 通過PCR引物設計軟件Primer Premier 5.0設計lncRNA ABHD11-AS1、STAT1、STAT3和GAPDH的引物序列，由上海生工生物公司合成。具體序列如下：ABHD11-AS1上游引物：5'-AGGAGTGGTTGCATTTGG GA-3'，下游引物：5'-CCCACCACGCAGTGAATAGT-3'；STAT1上游引物：5'-GCACTATTGCCCCTGGAGTT- 3'，下游引物：5'-CTACGACACTCTCGAGCTGC-3'；STAT3上游引物：5'-TGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3'，下游引物：5'-CTGCTGGTCAATCTCTCCCA-3'；GAPDH 上游引物：5'-GGAAGGACTCATGACCACAGTCC-3'，下游引物：5'-TCGCTGTGAAGTCAGAGGAGACC-3'。引物干粉離心后用焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液配制成20 μmol/L，置于-20℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的轉(zhuǎn)染 將細胞以所需濃度接種，在24 h和48 h加入ABHD11-AS1 siRNA和對照siRNA，終濃度為10 nmol/L。根據(jù)說明書，使用Lipofectamine?RNAiMaxReagent在OptiMEM培養(yǎng)基中進行敲低。通過qRT-PCR檢測敲低率。

1.2.2 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)說明書，使用miRNeasy Mini試劑盒從組織或培養(yǎng)的細胞中分離總RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒，在標準條件下使用引物將1 μg總RNA用于20 μL終體積的逆轉(zhuǎn)錄反應。使用Power SYBR Green master Mix將1 μL 相應的cDNA 用于隨后的qRT-PCR反應，GAPDH的表達作為內(nèi)參，PCR擴增的條件為95℃10 min，（95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s）×40個循環(huán)。3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)采用公式RQ=2-ΔΔCt進行計算。

1.2.3 WST-1法檢測細胞增殖 將細胞以1×103個細胞/孔接種到96孔板上。在24 h和48 h時加入ABHD11-AS1 siRNA和對照siRNA。根據(jù)說明書，使用WST-1試劑（德國羅氏公司）在siRNA轉(zhuǎn)染后96～120 h測量細胞增殖能力。每個實驗重復3次。

1.2.4 克隆形成實驗 對于集落形成，將用ABHD11-AS1 siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染的肺癌細胞以2×102個細胞/孔接種在6孔板中。在37℃溫育10～14天后，使用0.1%結晶紫和20%甲醇作為染料溶液來固定和染色菌落。每孔中計數(shù)菌落數(shù)。超過50個細胞為1個克隆。每個實驗重復3次。

1.2.5 細胞遷移和侵襲測定 在Transwell室系統(tǒng)中測量非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲能力。將稀釋的細胞外基質(zhì)（ECM）凝膠溶液60 μL加入小室檢測侵襲能力。對于遷移能力的測定，利用小室并使用相同的方法但不加ECM凝膠溶液。將小室在37℃溫箱里孵育4 h，接下來，以1×105個細胞/孔接種在含有1%FBS 的100 μL 培養(yǎng)基中，將含有10%FBS的培養(yǎng)基500 μL加入小室外。然后將小室置于37℃細胞溫箱里孵育24～48 h。后用多聚甲醛和結晶紫染色，利用Image J軟件計算細胞數(shù)。每個實驗重復3次。

1.2.6 Western blot 法檢測蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白，在15% tricine-SDS-PAGE 凝膠上進行電泳分離；然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1.5 h，用ECL 化學發(fā)光液進行顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以表示，計數(shù)資料采用構成比（%）表示，124對配對的非小細胞肺癌和癌旁組織比較采用兩配對樣本t檢驗，采用Kaplan-Meier法計算生存函數(shù)，差異比較采用Log rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA ABHD11-AS1表達情況與預后分析

檢測248 例非小細胞肺癌與癌旁正常組織中ABHD11-AS1的表達量（圖1A）。非小細胞肺癌患者組織中ABHD11-AS1表達量顯著高于配對癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結合生存數(shù)據(jù)分析顯示ABHD11-AS1高表達，其總生存（over survival，OS）顯著低于ABHD11-AS1低表達組（P=0.002，圖1B）。

圖1 ABHD11-AS1 在非小細胞肺癌組織和癌旁組織中的表達水平及其與患者預后的關系，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 lncRNA ABHD11-AS1 表達與臨床病理特征的關系

分析lncRNA ABHD11-AS1 的表達與患者年齡、性別、臨床病理分期、病理類型及吸煙狀態(tài)的關系，結果發(fā)現(xiàn)lncRNA ABHD11-AS1 高表達組較低表達組吸煙患者較少（P=0.02）、分期較晚（P＜0.01）。高表達組的中位年齡為57.5歲，低表達組為59.0歲，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.33，表1）。

2.3 肺癌細胞與正常支氣管上皮細胞的表達水平

非小細胞肺癌細胞PC-9、H838、H1299和H1975的ABHD11-AS1表達水平顯著高于人肺支氣管上皮細胞BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PC-9和H838細胞的ABHD11-AS1表達水平更高，故選擇在PC-9和H838細胞中進行后續(xù)實驗（圖2）。

2.4 細胞增殖能力

本研究將4條ABHD11-AS1 siRNA（簡稱為siABHD11-AS1）混合后進行以下細胞功能及分子機制實驗。將siABHD11-AS1轉(zhuǎn)染進PC-9 和H838兩株非小細胞肺癌細胞中，檢測細胞增殖和集落形成能力。qRT-PCR顯示用siABHD11-AS1轉(zhuǎn)染后ABHD11-AS1表達顯著降低（P＜0.01，圖3A）。使用WST-1試劑檢測細胞增殖能力，結果顯示在PC-9和H838細胞系中ABHD11-AS1敲低96 h 后細胞抑制超過35%（P＜0.01，圖3B）。在PC-9和H838細胞系中抑制ABHD11-AS1后，集落形成顯著減少（P＜0.01，圖3C，D）。

表1 lncRNA ABHD11-AS1 的表達與肺癌患者臨床病理特征的關系

圖2 ABHD11-AS1 在非小細胞肺癌細胞系與正常支氣管上皮細胞中的表達水平，*P＜0.05

2.5 細胞遷移和侵襲能力

為了研究ABHD11-AS1對非小細胞肺癌細胞中細胞遷移和侵襲的潛在作用，本研究進行Transwell實驗。結果發(fā)現(xiàn)在PC-9和H838細胞中敲低ABHD11-AS1后細胞遷移被抑制45%～90%（P＜0.05，圖4A）。細胞侵襲被抑制60%～80%（P＜0.01，圖4B）。研究表明ABHD11-AS1可能參與非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移潛在相關的機制。

圖3 敲低ABHD11-AS1抑制非小細胞肺癌細胞的增殖情況，*P＜0.05，**P＜0.01

圖4 敲除ABHD11-AS1表達抑制非小細胞肺癌細胞遷移與侵襲，*P＜0.05，**P＜0.01

2.6 癌基因蛋白STAT1和STAT3的表達

為進一步研究由ABHD11-AS1調(diào)節(jié)的潛在分子機制，本研究應用蛋白印跡方法檢測在PC-9和H838細胞中ABHD11-AS1敲低后表達改變的蛋白質(zhì)。結果發(fā)現(xiàn)在PC-9和H838細胞中用ABHD11-AS1 siRNA處理細胞72 h后致癌蛋白STAT1和STAT3均降低（圖5A）。研究表明，癌蛋白STAT1和STAT3可能在ABHD11-AS1網(wǎng)絡中調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起重要作用。隨后通過RT-PCR檢測該基因的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)在PC-9和H838細胞中STAT1和STAT3 mRNA無顯著變化，表明在ABHD11-AS1敲低后STAT1和STAT3基因是在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)節(jié)（圖5B，C）。

2.7 STAT1和STAT3影響非小細胞肺癌的增殖

進一步探討ABHD11-AS1是否通過癌蛋白STAT1和STAT3影響非小細胞肺癌的增殖，本研究后期敲除STAT1和STAT3的表達，先通過qRT-PCR實驗檢測其敲除率為65%～90%（圖6A，6B），再行WST-1實驗檢測非小細胞肺癌的增殖率明顯降低（圖6C，D）。研究表明STAT1和STAT3是ABHD11-AS1調(diào)節(jié)非小細胞肺癌生長的重要癌基因。

圖5 ABHD11-AS1調(diào)控的STAT1與STAT3蛋白和mRNA表達

圖6 分別敲除STAT1和STAT3后非小細胞肺癌細胞的增殖情況，*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs在人體細胞中廣泛表達，并作為關鍵調(diào)節(jié)因子影響其增殖、分化、凋亡和細胞周期等［6-7］。此外，lncRNA表達的改變與多種癌癥發(fā)病機制相關［8-9］。如lncRNA SNHG12在肺癌中高度表達，通過下調(diào)miR-138表達促進肺癌細胞增殖［10］。Liu等［11］發(fā)現(xiàn)lncRNA ZEB1-AS1在骨肉瘤中表達上調(diào)，并與晚期臨床分期和預后不良有關。體外實驗表明，lncRNA ZEB1-AS1通過激活ZEB1促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移。然而，lncRNA在肺癌中的生物學功能及其進一步的分子機制尚不明確。

lncRNA ABHD11 的反義鏈RNA1，簡稱lncRNA ABHD11-AS1，位于人類7 號染色體q11.23，是一種新鑒定的lncRNA。既往研究報道ABHD11-AS1在多種腫瘤中失調(diào)，包括胃癌［12］、膀胱癌［13］、子宮內(nèi)膜癌［14］和上皮性卵巢癌［15］。然而，ABHD11-AS1 在非小細胞肺癌中是否異常表達及其生物學功能的相關研究較少。

本研究結果表明lncRNA ABHD11-AS1 在非小細胞肺癌組織和癌細胞系中過表達。在非小細胞肺癌細胞中用siRNA 敲低lncRNA ABHD11-AS1 表達后，細胞增殖和集落形成減少。轉(zhuǎn)移是癌癥的另一種重要惡性行為。據(jù)報道，lncRNA 參與調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移，如MALAT-1［16］和HOX 反義基因間RNA（HOTAIR）［17］，本研究發(fā)現(xiàn)ABHD11-AS1敲低后非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲能力顯著下降，表明ABHD11-AS1可能參與非小細胞肺癌的分子轉(zhuǎn)移過程。ABHD11-AS1 通過復雜的機制誘導腫瘤發(fā)生，包括激活細胞存活和增殖的信號通路。既往研究表明，ABHD11-AS1 的失調(diào)參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程。如胃癌患者的胃液ABHD11-AS1表達明顯較高，其可作為胃癌篩查的潛在生物標志物［12］。ABHD11-AS1在膀胱癌中高表達，與臨床生物學特征呈正相關，其降低可抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移，證明其是膀胱癌的治療靶點［13］。lncRNA ABHD11-AS1通過靶向細胞周期蛋白D1促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和侵襲，在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮致癌作用［14］。另一項研究表明［15］，上皮性卵巢癌中ABHD11-AS1 的表達水平顯著上調(diào)，ABHD11-AS1 的敲低在體內(nèi)、外均抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖和遷移。上述結果均表明ABHD11-AS1 參與多種腫瘤發(fā)生，并且在其中充當癌基因的角色。

本研究結果顯示在非小細胞肺癌細胞中敲低ABHD11-AS1表達后，致癌蛋白STAT1和STAT3的表達降低。敲低STAT1和STAT3，細胞增殖同時減少，表明這兩種蛋白可能參與ABHD11-AS1調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞增殖的信號通路。STAT 家族包括7 個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6b。STAT1是其中重要成員之一，參與細胞生長調(diào)節(jié)、抗病毒和免疫防御［18-19］。STAT1和STAT3是人類惡性腫瘤中最常見被激活的STAT家族成員，是多種腫瘤的致癌信號通路和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中的重要分子，并可以被多個促炎因子和生長因子活化［20］。STAT1和STAT3生物作用廣泛，可以直接或間接調(diào)控相關基因，在細胞增殖、凋亡、分化和血管生成等方面發(fā)揮重要作用。近年研究［21-25］已證實，STAT3在許多造血系統(tǒng)腫瘤及實體腫瘤中均有異常表達，如白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌及前列腺癌等。STAT3參與了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及抗凋亡，能夠誘導抗凋亡蛋白、細胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子等的表達［20］。

綜上所述，ABHD11-AS1 可能通過影響STAT1和STAT3 癌蛋白的表達，影響非小細胞肺癌細胞增殖、集落形成以及遷移和侵襲。本研究表明ABHD11-AS1 是人類非小細胞肺癌細胞中的功能性lncRNA，在非小細胞肺癌進展中起重要作用。