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    平喘固本膏方對COPD穩(wěn)定期大鼠模型樹突狀細胞及T淋巴細胞的影響※

    2019-02-21 06:43:26彭草云阮月芳葉甫澄
    中醫(yī)藥通報 2019年6期
    關鍵詞:膏方氨茶堿平喘

    ●彭草云 阮月芳 葉甫澄 張 峰

    近年來樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的發(fā)病中所起的作用逐漸受到重視,認為其在COPD的發(fā)病中充當“前哨”的作用,當DCs獲取外來抗原后,將其遞呈給T淋巴細胞主要是CD8+T細胞,進而發(fā)揮免疫效應,促使COPD的發(fā)病[1]。平喘固本湯系治療肺脹肺腎氣虛證的名方,該方具有補肺納腎、降氣化痰之功。筆者前期的研究表明平喘固本膏方對改善COPD穩(wěn)定期患者的咳嗽氣喘癥狀有一定療效[2],并可降低COPD大鼠血清白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factors,TNF-α)水平[3]。為進一步研究平喘固本膏治療COPD的作用機理,筆者又將其對COPD穩(wěn)定期大鼠模型樹突狀細胞及T淋巴細胞的影響進行了研究,報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物 SD大鼠60只,雄性,體重200±20g。由嘉興醫(yī)學院動物房提供。

    1.1.2 實驗藥物 平喘固本膏方:黨參300g,五味子120g,胡桃肉240g,靈磁石360g,蘇子300g,款冬花240g,法半夏240g,橘紅120g。上藥加適量水浸泡24小時,后煎煮取汁、過濾共3次,將3次煎液混合后濃縮至2 000 mL左右,加入細研成粉的坎臍粉、沉香粉各300g,最后加入蜂蜜250g煉制收膏,每毫升膏劑約含生藥1.26g。膏方由嘉興市中醫(yī)院制劑室制作。氨茶堿片:天津力生制藥股份有限公司(國藥準字H12020118)。脂多糖,購自Sigma公司。

    1.1.3 主要試劑與儀器 抗大鼠白細胞分化抗原分化群80(cluster of differentiation 80,CD80)單克隆抗體(ab62636)及抗大鼠CD86單克隆抗體(ab119857)由艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司提供,大鼠IL-10(EKR30159)及大鼠IL-12(EK-R30163)由上海酶研生物科技有限公司提供,CD4抗體(11-0040-81)、CD8抗體(12-0084-82)由Thermo Fisher Scientific提供。全自動流式細胞分析儀(美國Becton Dikingson公司,BD FACSVerse),酶標儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)購自芬蘭Thermo公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 動物分組與造模 隨機分為6組:COPD穩(wěn)定期模型組,高、中、低劑量膏方治療組、氨茶堿組和空白組。除空白組外,均建立COPD穩(wěn)定期模型,按宋一平等[4]的方法建立,即第1、14天氣管內注入脂多糖200μg/200μl,第2~28天在容積為84 L的密閉箱內熏雄獅牌香煙,0.5 h/每日上午。

    1.2.2 給藥方法 造模成功后每日1次灌胃給藥,連續(xù)給藥30天。給藥劑量根據(jù)大鼠體重按成人一日劑量折算[按公式大鼠等效劑量(mg/kg)=折算系數(shù)×成人劑量(mg/kg)]計算出大鼠等效劑量[5],以等效劑量為中劑量即1.512g/(200g·d)。高劑量組以6.048g/(200g·d)灌胃,中劑量組以1.512g/(200g·d)灌胃,低劑量組以0.378g/(200g·d)灌胃。氨茶堿組用氨茶堿片以7.2mg/(200g·d)灌胃,模型組灌以生理鹽水。

    1.2.3 取材和指標測定 實驗結束后頸動脈取血制備血清,IL-10和IL-12檢測采用雙抗體夾心ABCELISA法,CD4+T、CD8+T采用流式細胞儀檢測。

    1.3 計算機圖像分析以胞膜、胞質或胞核染成棕黃色或黃色的細胞為陽性細胞。對比右下肺HE及免疫組化染色圖片,確定大鼠肺實質的DCs數(shù)量。每張切片隨機取5個高倍視野,使用IPP6.0軟件計算陽性細胞數(shù)以及總細胞數(shù),陽性率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×1 000‰,取平均值作為該切片的陽性細胞率。

    1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理,計量資料采用方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。本實驗各組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗P值均大于0.05,采用單因素方差分析,即One-Way ANOVA,以LSD分析方法進行兩兩比較。

    2 結果

    2.1 各組大鼠血清IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T檢測結果顯示,高劑量組在降低IL-2及CD8+T方面優(yōu)于氨茶堿(P<0.05),而高中低各劑量組及氨茶堿組在降低IL-10、CD4+T及CD4+T/CD8+T方面無明顯差異(P>0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T結果()

    表1 各組大鼠IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T結果()

    注:#各組的總體比較:CD4各組比較F=1.596,P=0.186,CD4/CD8#各組比較F=1.829,P=0.132,其余指標各組比較P值均為0.000;△高劑量組與氨茶堿組比較:IL-12兩組比較P=0.027,CD8兩組比較P=0.0275,余指標比較P值均大于0.05

    2.2 大鼠DC表面分子標記物表達檢測結果顯示,膏方各組均能降低COPD大鼠DC表面分子標記物CD80及CD86的表達,在降低CD80的表達上,高劑量組與氨茶堿組比較有顯著差異(P<0.05),但中劑量組及低劑量組與氨茶堿比較無顯著差異(P>0.05);在降低CD86的表達上,高劑量組及中劑量組與氨茶堿比較均有顯著差異(P<0.05),而低劑量組與氨茶堿比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

    3 討論

    DCs廣泛分布于肺內各級氣道、血管、實質、肺泡腔以及臟層胸膜,它是目前已知的唯一可以激活初始T細胞的抗原提呈細胞,其對T細胞免疫應答和免疫耐受均具有調節(jié)作用[6]。DCs可表達多種輔助分子,其中CD80和CD86是初始CD4+T淋巴細胞的激活所需的最重要的共刺激分子,CD80能夠誘導輔助性T細胞(helper T cell,Th)細胞分化為Th1細胞,而CD86能夠誘導Th細胞分化為Th2細胞[7-8]?;罨臉渫粻罴毎ㄟ^釋放IL-12和表達協(xié)同共刺激因子,使局部固有的CD8+T細胞活化,從而產(chǎn)生誘發(fā)和維持局部免疫炎癥反應[9]。

    表2 各組大鼠DC表面分子標記物表達陽性率(,‰)

    表2 各組大鼠DC表面分子標記物表達陽性率(,‰)

    注:#各組的總體比較:CD80#與CD86??傮w比較P值均為0.000;△高劑量組與氨茶堿組比較:CD80兩組比較P=0.011,CD86兩組比較P=0.007;*中劑量組與氨茶堿組比較:CD80兩組比較P=0.159,CD86兩組比較P=0.039;※低劑量組與氨茶堿組比較:CD80兩組比較P=0.134,CD86兩組比較P=0.173

    T淋巴細胞尤其是CD8+T在COPD的發(fā)生過程中扮演著重要的角色。研究證實,不論在COPD急性加重期還是在穩(wěn)定期,CD4+T和CD8+T均明顯升高。CD4+T細胞中的Th1通過分泌IL-2和γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)等細胞因子,誘導產(chǎn)生基質金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12,MMP-12)和MMP-9,從而導致彈性蛋白水解和肺氣腫形成,Th17細胞也可通過分泌IL-17等炎性細胞因子導致肺氣腫形成[10]。CD8+T通過分泌IFN-γ 和TNF-α 對感染和改變的宿主細胞起到溶解的作用,從而在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。本研究顯示,模型組CD4+T和CD8+T均較空白組升高,但CD8+T升高更為明顯,差異有統(tǒng)計學意義。高劑量膏方在降低CD8+T方面優(yōu)于氨茶堿,但中劑量膏方和低劑量膏方則與氨茶堿比較無明顯差異。

    然而,T細胞要發(fā)揮作用,需要樹突狀細胞的輔助。研究證實,長期煙霧暴露后,不僅巨噬細胞、中性粒細胞和CD8+T細胞等炎性細胞增多,肺部DCs數(shù)量及亞群功能也會發(fā)生變化,從而導致免疫功能失調[12]。大多數(shù)研究認為,在COPD患者和動物模型中DCs的數(shù)量增多[13-14],并且在COPD患者中DCs表面CD80和CD86的表達水平明顯升高,而白藜蘆醇等藥物可有效地抑制COPD中CD80和CD86等共刺激分子的激活[15]。

    既往的研究表明,平喘固本湯膏方在改善COPD穩(wěn)定期患者的咳嗽氣喘癥狀及降低COPD大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α 水平等方面有一定作用[2-3]。其對DCs的作用如何尚不清楚,而中藥是否也能通過調節(jié)DCs從而達到治療COPD的效果尚未見報道。本研究結果證實,經(jīng)煙熏及氣管內注射脂多糖處理后的大鼠肺組織中CD80和CD86水平顯著升高(P>0.05)。在降低CD80方面,平喘固本膏方高劑量組優(yōu)于氨茶堿組,但中劑量組及低劑量組與氨茶堿組比較無顯著差異。在降低CD86方面,高劑量組及中劑量組優(yōu)于氨茶堿組,但低劑量組與之比較無顯著差異,顯示平喘固本膏方在調節(jié)DCs細胞方面呈劑量依賴性。

    IL-10是一種抑制性細胞因子,能夠抑制IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等多種細胞因子的合成及活性。IL-10降低及其調控分泌的促炎癥細胞因子的增加可能是氣道持續(xù)炎癥并導致氣道重塑、氣流受限、肺組織破壞及肺氣腫等病理過程的重要機制[16]。IL-12作為巨噬細胞分泌的炎性因子,它不僅可獨立作用于NK細胞和細胞毒T細胞,介導細胞毒性炎性反應,在COPD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。本研究表明,模型組IL-10明顯低于其余各組,而模型組IL-12則明顯升高。與氨茶堿組比較,高劑量膏方能更好地降低IL-12,但在升高IL-10方面,膏方各劑量組與氨茶堿比較均無明顯差異。

    因此,筆者初步的研究結果證明,高劑量平喘固本湯膏方在降低IL-12、CD8+T及CD80和CD86等方面有一定作用,推測平喘固本湯膏方除通過調節(jié)IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 等炎癥介質起到治療COPD的作用外,還可能與調節(jié)T淋巴細胞及DCs有關,值得深入研究。COPD穩(wěn)定期的藥物治療以吸入劑為基礎,但茶堿緩釋片口服仍具有改善肺功能、提高生活質量的作用[17],因此,我國2013年COPD診治指南將茶堿作為吸入劑的替代方案之一[18]。由于實驗研究的限制,筆者采用了氨茶堿片而非茶堿緩釋片作為對照藥物,可能對研究結果存在一定的影響,今后需進一步改進研究方案。

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