核移植介導(dǎo)的哺乳動物體細(xì)胞核重編程研究進(jìn)展

吳霄 莊站偉 馬曉莉 黃思秀 李紫聰 徐錚

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心 動物科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州 510642）

體細(xì)胞核移植技術(shù)（Somatic cell nuclear transfer，SCNT），也稱克隆，是一種利用體細(xì)胞潛在的發(fā)育全能性去獲得新的個體的技術(shù)。自1997年世界上第一例克隆羊“多利（Dolly）”出生至今，已有20多種哺乳動物被成功克隆出來，而2018年報(bào)道的世界首例克隆猴更是對靈長類動物研究的重大突破［1-2］。SCNT存在巨大的應(yīng)用價(jià)值，如種質(zhì)資源保護(hù)、良種擴(kuò)繁、實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)，以及以器官移植為目的的治療性克隆?？寺『锏某晒σ彩筍CNT在研究人類阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈癥等疾病上的應(yīng)用更近一步。

盡管SCNT在生命科學(xué)領(lǐng)域取得了一些成就，但該技術(shù)仍然存在巨大的應(yīng)用缺陷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，哺乳動物的SCNT胚胎的體內(nèi)發(fā)育效率約1%-5%（出生數(shù)/卵裂期胚胎移植數(shù)），且克隆產(chǎn)生的后代往往出現(xiàn)死亡率極高和諸多發(fā)育缺陷的現(xiàn)象，如巨胎癥、呼吸道疾病、免疫缺陷等［3-4］。在過去20年里，各國學(xué)者對SCNT的操作流程進(jìn)行了各種優(yōu)化，但這對提高克隆效率的作用甚微，阻礙SCNT胚胎正常發(fā)育的原因主要來自于胚胎自身發(fā)育過程中出現(xiàn)的供體細(xì)胞核重編程異常［5］。受精胚胎的重編程是指高度分化的精子和卵母細(xì)胞在形成受精卵后，胚胎的核發(fā)生一系列變化，恢復(fù)細(xì)胞發(fā)育的全能性，以指導(dǎo)胚胎的發(fā)育過程。但是SCNT胚胎的形成有別于受精胚胎，供體細(xì)胞核需要恢復(fù)其發(fā)育全能性以指導(dǎo)重構(gòu)胚的正常發(fā)育，但這個過程存在著諸多障礙，尤其是表觀遺傳水平的重編程錯誤，最終只有極少數(shù)的胚胎能夠正常發(fā)育、附植和出生。本文通過與受精胚胎的比較，重點(diǎn)介紹了哺乳動物SCNT胚胎中的供體細(xì)胞核重編程異?，F(xiàn)象及其表觀遺傳修復(fù)機(jī)制的研究進(jìn)展，并對一些與發(fā)育過程中的重編程相關(guān)的細(xì)胞和分子事件進(jìn)行探討。

1 早期SCNT胚胎的發(fā)育過程

供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞形成重構(gòu)胚的過程主要包括注射、融合和激活3個步驟。這期間，重構(gòu)胚發(fā)生了一系列變化。供體細(xì)胞核進(jìn)入卵母細(xì)胞質(zhì)后，核膜迅速破裂（Nuclear envelope breakdown，NEBD），失去核膜的染色體由存在于卵母細(xì)胞質(zhì)中的M期促進(jìn)因子（M-phase-promoting factors，MPFs）促發(fā)染色體超前凝聚（Premature chromosome condensation，PCC）。在PCC期間，結(jié)合于染色體上的蛋白質(zhì)會發(fā)生解離［6］。供體細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞融合后，通過電激活等物理方法和氯化鍶、鈣離子激活等化學(xué)方法激活卵母細(xì)胞，完成第二次減數(shù)分裂。重構(gòu)胚激活后重新形成核膜，并開始進(jìn)行DNA復(fù)制，在此期間由于重構(gòu)胚的細(xì)胞核加入大量卵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生急劇變化［7］。隨著合子基因組激活（Zygotic genome activation，ZGA）的啟動，重構(gòu)胚基因組逐漸恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄，卵母細(xì)胞胞質(zhì)中儲存的RNA很快降解并由新合成的RNA取代，啟動染色體重塑和其他表觀遺傳修飾的重編程。

2 核移植后的表觀遺傳修飾變化

SCNT后基因組發(fā)生的表觀遺傳修飾事件主要包括染色質(zhì)重塑、DNA甲基化、組蛋白修飾、印記基因的表達(dá)、X染色體失活等過程。

2.1 染色體重塑

染色體結(jié)構(gòu)的改變與D NA復(fù)制、DNA重組、基因表達(dá)等生物學(xué)過程緊密相關(guān)。多能性細(xì)胞的特征在于比高度分化的體細(xì)胞具有更開放的染色質(zhì)狀態(tài)［8］。胚胎發(fā)育過程中，基因組形成大量的染色體開放區(qū)域促使位于該開放區(qū)域的關(guān)鍵調(diào)控元件介導(dǎo)胚胎基因組轉(zhuǎn)錄的啟動。此過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子會與封閉的染色質(zhì)區(qū)域結(jié)合，打開染色質(zhì)，如Oct4、Sox2、Kif4［9-10］。在 SCNT胚胎中，供體細(xì)胞染色體也需要通過重塑來啟動胚胎的發(fā)育全能性［11］。Djekidel等對1細(xì)胞期的體外受精胚胎和SCNT胚胎以及作為供體的卵丘細(xì)胞進(jìn)行基于微量樣品的DNase I超敏感位點(diǎn)測序（low-input DNase I hypersensitive sites sequencing，liDNase-seq）， 發(fā) 現(xiàn)SCNT胚胎染色質(zhì)重塑主要在激活后12 h內(nèi)完成，但是，與受精胚胎相比，SCNT胚胎的大量DNaseI超敏感位點(diǎn)在供體細(xì)胞核重編程過程中丟失［12］。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1家族成員Jun，會通過阻止Oct4、Sox2、Kif4的作用來抑制供體細(xì)胞核的重編程［13］。另一項(xiàng)研究表明與受精胚胎相比，SCNT胚胎在染色質(zhì)重塑的過程中部分區(qū)域未能成功進(jìn)行重編程，而這些區(qū)域伴隨著H3組蛋白第9位賴氨酸三甲基化（Histone3 lysine9 trimethylation，H3K9me3）和 DNA甲基化的富集，阻礙SCNT胚胎的重編程［12］。

2.2 DNA甲基化

DNA甲基化是生物體基因組中的一個重要表觀遺傳修飾，其中，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）是哺乳動物中的主要甲基化模式。5mC的建立與維持是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）進(jìn)行；而甲基化的擦除則是通過雙加氧酶（Ten-eleven translocation，TET）介導(dǎo)將胞嘧啶上的甲基氧化為羥甲基、醛基和羧基，然后通過DNA糖基化酶進(jìn)行堿基切除修復(fù)［14］。在胚胎發(fā)育早期，受精卵會發(fā)生廣泛的去甲基化，其中父本基因組主動去甲基化，母本基因組被動去甲基化，基因組的低DNA甲基化狀態(tài)為胚胎的全能性奠定了分子基礎(chǔ)［15-16］。SCNT胚胎基因組的甲基化狀態(tài)來源于其供體細(xì)胞，在重編程過程中去甲基化不完全，多數(shù)啟動子仍然維持高甲基化。精子的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與供體成纖維細(xì)胞核之間的差異可能限制了SCNT中去甲基化機(jī)制的進(jìn)行［17］。

通過小分子化合物DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，如 5-氮 雜 -2'-脫 氧 胞 苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dc）、zebularine、RG108等，降低供體細(xì)胞或胚胎基因組的甲基化水平是提高克隆效率的一個重要方法。通過5-aza-dc、zebularine處理供體細(xì)胞或SCNT胚胎的研究在小鼠、豬、牛等物種中都取得了一定的成果，成功降低了DNA甲基化的水平并在一定程度提高了SCNT胚胎的發(fā)育效率［18-21］。但是5-aza-dc 這類化合物對細(xì)胞具有毒性，對細(xì)胞生長存在危害。與之相比，RG108沒有細(xì)胞毒性或遺傳毒性作用，是一種較為理想的處理藥物。Zhai等［22］利用RG108處理后的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，成功提高了SCNT胚胎的囊胚率（24.72% vs. 18.38%）。另一方面，TET介導(dǎo)的去甲基化作用也可以降低基因組中的DNA甲基化水平，TET3介導(dǎo)的DNA去甲基化涉及受精卵中父本DNA的表觀遺傳重編程，對于重構(gòu)胚的發(fā)育非常重要。研究表明，卵母細(xì)胞中儲存的TET3可以使小鼠SCNT胚胎的DNA甲基化得到擦除，而SCNT胚胎在重編程過程中的TET3不足似乎是無法支持完整去甲基化的一個重要原因［15，23-24］。Han 等［25］通過在供體細(xì)胞中過表達(dá)TET3成功提高了克隆山羊的出生率（3.6% vs. 1.5%）。高紹榮教授團(tuán)隊(duì)的最新研究發(fā)現(xiàn)，小鼠SCNT胚胎去甲基化過程中存在再次甲基化的現(xiàn)象，已經(jīng)降低的基因組甲基化水平在二細(xì)胞期的SCNT胚胎中會再次提高，至四細(xì)胞期重新降低［26］。該研究在SCNT胚胎的2細(xì)胞階段還檢測到內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses，ERV）的長末端重復(fù)序列元件中存在異常DNA甲基化狀態(tài)［26］。由于ZGA通常以ERV的激活為特征，上述發(fā)現(xiàn)正好驗(yàn)證了SCNT胚胎未能進(jìn)行完整的ZGA的假設(shè)［27］。因此，Gao等［26］向去核卵母細(xì)胞注射了靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的小干擾RNA，阻礙DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，抑制了DNA重新甲基化，成功提高了小鼠SCNT胚胎的出生率（5.33% vs. 0.88%）。由于DNA去甲基化模式與發(fā)生階段在各個物種中是不保守的，這種在小鼠SCNT胚胎中重新甲基化的現(xiàn)象在其他物種中是否保守還有待驗(yàn)證。

2.3 組蛋白修飾

組蛋白的氨基末端位于核小體的核心結(jié)構(gòu)之外，作為一個信號位點(diǎn)與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。組蛋白修飾是指組蛋白的氨基末端與各種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生各種共價(jià)修飾，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，不同的修飾模式對基因表達(dá)有不同的調(diào)控作用［28］。在正常受精胚胎發(fā)育早期，母本基因組組蛋白維持原有狀態(tài)，而父本基因組組蛋白呈現(xiàn)高度乙?；?9-30］。而在SCNT胚胎中，激活后的組蛋白修飾狀態(tài)由供體細(xì)胞的狀態(tài)向類似于受精胚胎的狀態(tài)發(fā)育，但此前的研究發(fā)現(xiàn)，相比受精胚胎，SCNT胚胎始終保持著與供體細(xì)胞核相似的低水平的H4組蛋白第5位賴氨酸乙?；℉istone4 lysine4 acetylation，H4K5Ac）和高水平的H3K9me3。因此，糾正異常的組蛋白修飾狀態(tài)可能能夠改善胚胎的發(fā)育狀態(tài)。

通過組蛋白去乙?；敢种苿℉istone deacetylase inhibitor，HDACi）， 如 TSA、LAQ824 和 quisinostat等，調(diào)節(jié)組蛋白乙?；娇梢杂行Ц纳芐CNT 胚胎的發(fā)育效率［31-36］。Jin 等［36］利用 quisinostat處理SCNT胚胎，顯著提高了SCNT胚胎的囊胚率（19.0% VS 10.2%）。另外，組蛋白乙酰化和DNA甲基化可能是作為相互獨(dú)立的重編程障礙存在。一些研究利用TSA和5-aza-dc共同處理SCNT胚胎，在提高組蛋白乙?；耐瑫r降低DNA甲基化水平，在小鼠、牛等物種上都取得了一定的效果［37-39］。H3K9me3修飾作為轉(zhuǎn)錄抑制的標(biāo)記，已被證實(shí)是表觀遺傳修飾重編程的主要障礙之一。Matoba等［40］首先通過過表達(dá)組蛋白去甲基化酶Kdm4d去除SCNT胚胎的H3K9me3，將克隆小鼠的出生率提高了7-8倍（1% vs. 8.7%）。類似的方法在人、猴、牛、豬身上都取得了一定的成果，但效果不如小鼠的顯著［2，41-43］。Yang 等［44］發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的發(fā)育基因在胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中受到H3K27me3的調(diào)節(jié)，而在外胚層細(xì)胞中被DNA甲基化沉默，這種修飾模式的組合有利于維持和調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的可塑性，同時也說明了H3K27me3和DNA甲基化是促進(jìn)胚胎重編程的重要表觀異常修飾。張毅團(tuán)隊(duì)最近的研究則表明，H3K27me3修飾也是一種供體細(xì)胞核重編程的主要障礙［7］。由于SCNT胚胎在重編程過程中未能建立完整的H3K27me3修飾，從而導(dǎo)致一系列印記基因的異常表達(dá)并使胚胎發(fā)育阻滯［45-46］。

2.4 印記基因

基因組印記是指通過表觀遺傳修飾控制某些特定的等位基因僅表達(dá)來自父本或母本一方的基因的現(xiàn)象，這類等位基因被稱為印記基因。印記基因的表達(dá)具有時空特異性，即從原始生殖細(xì)胞發(fā)生到生物生長期間，基因組需要根據(jù)發(fā)育階段和組織的不同建立、維持、擦除印記，控制印記基因的表達(dá)［47］。

研究發(fā)現(xiàn)，在SCNT胚胎中，存在印記基因異常表達(dá)的現(xiàn)象，如表達(dá)量異常、錯誤表達(dá)或不表達(dá)等。Wei等［48］在異常死亡的初生克隆豬胎盤中檢測到IGF2，H19，PEG3和GRB1的表達(dá)量異常。Yang等［49］在死亡克隆犢牛的8個器官中發(fā)現(xiàn)了IGF2，IGF2R和H19的表達(dá)量異常。Hiroaki等［50］利用RNA測序鑒定出克隆小鼠的胎盤中Sfmbt2、Gab1、Slc38a4等印記基因出現(xiàn)雙等位基因表達(dá)的狀態(tài)。由于印記基因的功能往往與胎兒生長發(fā)育相關(guān)，因此印記基因的表達(dá)異常也是導(dǎo)致SCNT胚胎異常發(fā)育的主要原因之一。

了解基因組印記對印記基因表達(dá)模式的調(diào)控將有助于糾正SCNT胚胎中印記基因的異常表達(dá)。其中，DNA甲基化是哺乳動物中的主要基因組印記。印記基因中的部分CpG島在父母本基因組中具有顯著的DNA甲基化差異，稱為差異甲基化區(qū)域（Differentially methylated region，DMR）。DMR 是印記基因的單等位基因表達(dá)的決定因素，能夠維持印記基因在父母本中的差異表達(dá)。Hiroaki等［50］通過檢測DMR的DNA甲基化水平驗(yàn)證了SCNT胚胎中Gab1等印記基因的異常表達(dá)。Yu等［51］發(fā)現(xiàn)父本印記基因RTL1是影響豬SCNT胚胎早期流產(chǎn)的關(guān)鍵基因，由于RTL1在SCNT胚胎中的DNA甲基化印記未能正常擦除，抑制了其正常表達(dá)，而通過對RTL1進(jìn)行劑量補(bǔ)償表達(dá)，可以顯著地提高SCNT胚胎移植受體的懷孕率。與DNA甲基化相似的，組蛋白修飾也可以作為基因組印記控制印記基因的表達(dá)，Wee等［31］發(fā)現(xiàn)印跡基因NDN和XIST在克隆牛胚胎中的異常表達(dá)與H4K5Ac相關(guān)，這說明H4K5Ac可能是一種基因組印記。另外，H3K27me3修飾也被確認(rèn)是一種位于母本基因組上的印記，Inoue等［52］認(rèn)為H3K27me3修飾在卵子發(fā)生過程中逐漸建立并成為印記基因的印記，同時在植入前胚胎中母本H3K27me3的擦除會誘導(dǎo)X染色體失活。

2.5 X染色體失活

X染色體失活（X-chromosome inactivation，XCI）是指在哺乳動物中，雌性個體選擇性失活一條X染色體來保證雌雄個體在X染色體連鎖基因的基因表達(dá)量的一致性的過程［53］。在雌性的受精胚胎發(fā)育過程中，X染色體會始終保持一條染色體失活。早前的研究在SCNT胚胎中檢測到X染色體存在異常表達(dá)，胚胎細(xì)胞中出現(xiàn)了一條、兩條激活的X染色體或沒有染色體激活的現(xiàn)象［54］。由于XCI主要通過印記基因Xist轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）并包裹X染色體形成，因此XCI的異常一般是Xist基因的異常表達(dá)引起的。研究表明通過敲除或干擾Xist基因可以有效的糾正異常XCI，并顯著提高小鼠的克隆效率［55］。同時這種方法對大型哺乳動物克隆效率的提高也起到了一定的效果［43，56-57］。但是敲除Xist基因的方法對克隆動物的生長及繁育有巨大的弊端，糾正Xist異常激活的機(jī)制并維持單個X染色體激活才是更持續(xù)性的策略。研究發(fā)現(xiàn)，Xist在卵母細(xì)胞中一直保持沉默直到胚胎激活后才被激活，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為這期間Xist的母本印記是DNA甲基化。但是近年的研究表明Xist的母本印記與另外兩種印記有關(guān)，即H3K9me3 和 H3K27me3［52，58］。這兩種印記都是通過在Xist上富集來抑制該基因的表達(dá)，但在SCNT胚胎中均檢測到兩種印記的喪失。這些研究暗示通過建立印記沉默Xist可能是維持單個X染色體正常激活的有效措施。

3 其他重編程事件

除了上述幾種表觀遺傳修飾機(jī)制，還有許多其他的重編程事件被證明與胚胎發(fā)育相關(guān)，如端粒長度的維持、lncRNA的調(diào)控、ERV的轉(zhuǎn)錄激活，這些重編程活動可能也會影響SCNT胚胎的正常發(fā)育。端粒在細(xì)胞分裂過程中會逐漸縮短，當(dāng)?shù)竭_(dá)某個閾值時，細(xì)胞會停止分裂并進(jìn)入死亡程序。研究發(fā)現(xiàn)，克隆羊Dolly的端粒長度僅為正常長度的80%，同時在豬、牛等其他物種中也發(fā)現(xiàn)克隆后代端?？s短的現(xiàn)象［59-61］。端粒長度的維持和延長需要端粒酶同端粒結(jié)構(gòu)的結(jié)合來進(jìn)行，而端粒結(jié)構(gòu)又受端粒表觀遺傳修飾的調(diào)節(jié)［62］。因此，SCNT胚胎的異常的表觀遺傳修飾和染色質(zhì)開放性可能會改變端粒酶對端粒的調(diào)控而影響端粒長度［63］。lncRNA在細(xì)胞分化和生物體發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能，已經(jīng)證明卵母細(xì)胞的lncRNA在核重編程和早期胚胎發(fā)育中具有關(guān)鍵作用，尤其是染色體重塑的過程中。胚胎在不同的發(fā)育階段也會受到不同lncRNA的調(diào)控，即lncRNA的調(diào)控具有階段特異性［64-65］。而Wu等［66］研究則表明階段特異性的lncRNA未在SCNT胚胎中正確表達(dá)，并且卵母細(xì)胞來源的lncRNA也未在ZGA后降解。lncRNA的正常降解和轉(zhuǎn)錄過程可能在SCNT胚胎中受到抑制，從而導(dǎo)致了胚胎的發(fā)育阻滯。上文提及的ERV是在表觀遺傳修飾重編程期間重新連接基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的多功能參與者，在ZGA時轉(zhuǎn)錄激活，然后通過DNA甲基化，組蛋白修飾，轉(zhuǎn)錄后沉默等機(jī)制抑制。因此，研究ERV活化可以為研究ZGA過程的分子機(jī)制和提高SCNT胚胎的發(fā)育潛力提供新的思路［67］。

4 展望

在SCNT中，供體細(xì)胞核的重編程存在諸多障礙，尤其是表觀遺傳修飾的重編程。如何研究并展現(xiàn)SCNT胚胎的重編程過程，了解其與受精胚胎發(fā)育的差異，并且糾正這種差異是今后SCNT研究亟需解決的問題。隨著組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，胚胎發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組的變化得以呈現(xiàn)。尤其是近十年來，基于微量樣品的測序技術(shù)開始應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的研究，如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細(xì)胞甲基化測序。這些技術(shù)共同描繪出受精胚胎和SCNT胚胎發(fā)育重編程過程中的轉(zhuǎn)錄組及表觀修飾組的動態(tài)圖譜，對了解SCNT胚胎發(fā)育的屏障有著重要的意義。正常受精胚胎從原始生殖細(xì)胞的生成便已經(jīng)開始為重編程做準(zhǔn)備，而SCNT胚胎的正常發(fā)育只能依靠供體細(xì)胞核的重編程，最終只有少數(shù)胚胎能夠正確完成重編程并順利發(fā)育。近期的一項(xiàng)研究建立了一種稱為“Waddington-OT”的方法，這種方法能夠推斷祖先后裔的命運(yùn)，并對其可能的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行建模。同時該研究還預(yù)測并證實(shí)了能夠提高細(xì)胞重編程效率的轉(zhuǎn)錄因子Obox6和細(xì)胞因子GDF9［68］。Waddington-OT方法及其他推演細(xì)胞發(fā)展軌跡的研究將使了解胚胎重編程中的細(xì)胞命運(yùn)并加以調(diào)控成為可能，如何運(yùn)用這類方法來提高SCNT的效率將會成為未來研究的一個重要方向。