細(xì)胞外泛素及其受體CXCR4與AMI相關(guān)性研究進(jìn)展*

紀(jì)逸群，姚佳璐，何 楊

(1.蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，江蘇蘇州 215123； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院，江蘇蘇州 215008)

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，居民生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整變化，中國(guó)心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)負(fù)擔(dān)日益加重，現(xiàn)患CVD人數(shù)約有2.9億[1]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是最常見(jiàn)的心血管疾病之一，AMI及其進(jìn)展而來(lái)的心力衰竭，是全球死亡率最高的疾病之一。最新研究顯示，我國(guó)AMI并發(fā)心力衰竭的患者在院期間死亡率為30%[2]。AMI后進(jìn)行性心室重構(gòu)是基因表達(dá)改變引起的分子、細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)改變，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能的惡化。目前可采取藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、心臟器械輔助治療和心臟移植等方法，在一定程度上可以緩解癥狀，降低病死率，但并不能完全逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的進(jìn)展，AMI目前仍是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致心源性死亡的主要原因[3]。因此，如何提高缺血區(qū)心肌細(xì)胞的存活，是改善梗死后左室重構(gòu)、提高疾病預(yù)后的關(guān)鍵。

泛素(ubiquitin，UB)是一種廣泛存在于多種細(xì)胞的高度保守的低分子量多肽，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解、受體內(nèi)吞、胞內(nèi)信號(hào)分子活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等功能[4-7]。此外，UB還微量存在于各種體液中，稱細(xì)胞外泛素或游離泛素(free ubiquitin，fUB)。在多種疾病和病理狀態(tài)下均可見(jiàn)fUB濃度升高[8-12]，已有研究發(fā)現(xiàn)fUB具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)細(xì)胞凋亡或增殖分化等作用[13-20]。趨化因子受體4(CXCR4)被發(fā)現(xiàn)是fUB的胞外受體，且泛素與基質(zhì)衍生因子-1a(SDF-1a)具有不同的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)[21]。最近相關(guān)研究表明，fUB可能通過(guò)受體CXCR4影響心臟組織中多種細(xì)胞的形態(tài)和功能，因而可能參與AMI后心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。本文對(duì)此作一綜述，以期為AMI的發(fā)生、發(fā)展及臨床診療提供新的認(rèn)識(shí)和思路。

1細(xì)胞外泛素及其受體CXCR4的發(fā)現(xiàn)生理情況下fUB微量存在于血液、尿液和腦脊液等體液中[22]，在THP1細(xì)胞、人T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)其可與CXCR4結(jié)合并引起鈣離子內(nèi)流[23]。CXCR4可參與調(diào)節(jié)器官生成、造血、心血管系統(tǒng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染等[24]。多種疾病和病理過(guò)程可見(jiàn)體液中泛素水平升高。燒傷伴吸入性肺損傷患者肺泡灌洗液中泛素水平升高，濃度與病情嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)，與動(dòng)脈氧和正相關(guān)[8]。創(chuàng)傷性腦損傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中泛素濃度升高[9]。此外，腎衰竭及血液透析患者、創(chuàng)傷及燒傷患者、寄生蟲(chóng)及過(guò)敏性疾病患者血漿或血清泛素濃度均有異常升高[10-13]。

相關(guān)研究表明，fUB具有抗菌、抑炎、調(diào)控免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活等功能。其C端可跨越真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性從而抑制真菌生長(zhǎng)[14]，LEDGRTLSDY肽段(UB50-59)具有與環(huán)孢素相當(dāng)?shù)拿庖咭种苹钚?，可抑制?xì)胞免疫和體液免疫[15]。靜脈輸注fUB可以增強(qiáng)大鼠肺缺血再灌注損傷中Th2型細(xì)胞因子反應(yīng)，減輕水腫程度，提高肺功能[16]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fUB具有增強(qiáng)Treg細(xì)胞免疫抑制活性的功能[17]。fUB對(duì)細(xì)胞存活的影響則具有細(xì)胞特異性。其可通過(guò)蛋白酶體降解STAT3進(jìn)而誘導(dǎo)人造血干細(xì)胞凋亡[18]，抑制KT3，K562，Daudi等白血病細(xì)胞存活，對(duì)于HL60和T-ALL細(xì)胞則有刺激生長(zhǎng)作用[19]，體內(nèi)fUB輸注可延長(zhǎng)小鼠同種異體皮膚移植物的存活[20]。

2細(xì)胞外泛素及CXCR4在AMI及心室重構(gòu)中的功能

2.1 CXCR4與AMI及心室重構(gòu) 近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CXCR4受體在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和AMI及心室重構(gòu)中具有心臟保護(hù)作用。在Apoe-/-或Ldr-/-小鼠中飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化，使用CXCR4拮抗劑或CXCR4基因沉默后，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[25]。過(guò)表達(dá)CXCR4的小鼠能顯著降低壓力超載引起的心室重構(gòu)，增加毛細(xì)血管密度，提高心臟功能[26]。CXCR4基因敲除小鼠在ISO(異丙腎上腺素)誘導(dǎo)的心室重構(gòu)中具有更高的心衰風(fēng)險(xiǎn)和更低的心臟功能[27]。AMI小鼠中DMOG誘導(dǎo)CXCR4高表達(dá)可顯著提高梗死區(qū)心肌細(xì)胞的存活和心功能[28]。37例ST段抬高型AMI患者中發(fā)現(xiàn)有CXCR4升高，在動(dòng)脈壁粥樣硬化斑塊中與CD68+細(xì)胞共定位[29]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在人動(dòng)脈粥樣斑塊中沉積增加，且濃度與年齡、高血壓、高膽固醇血癥及吸煙史等心血管病危險(xiǎn)因子正相關(guān)[30]。Wistar大鼠心梗模型中，外周血單核細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)上調(diào)[31]。小鼠AMI后3 h檢測(cè)到SDF-1a mRNA升高。于AMI發(fā)生前30 min注射SDF-1a可有心臟保護(hù)作用，減少梗死面積。使用CXCR4特異性阻斷劑AMD3100可阻斷SDF-1a的心臟保護(hù)效應(yīng)，說(shuō)明SDF-1a通過(guò)CXCR4發(fā)揮作用。分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺血缺氧處理后，SDF-1a表達(dá)增高，通過(guò)CXCR4增加ERK和AKT磷酸化水平，降低JNK和P38水平，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CXCR4的大鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧處理后，與對(duì)照組相比，胞漿鈣離子超載程度相同，但線粒體膜通透性的增加受到抑制，線粒體腫脹程度降低，心肌細(xì)胞死亡減少65%，提示CXCR4在缺血心肌細(xì)胞中還具有線粒體保護(hù)功能[33]。在心臟內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1a/CXCR4激活A(yù)KT后，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和血管新生[34]。此外，CXCR4可增加干細(xì)胞歸巢到心梗缺血區(qū)，大鼠心臟缺血/再灌注模型中，注射過(guò)表達(dá)CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心梗部位歸巢增多并可顯著改善心功能[35]。

2.2 fUB與AMI及心室重構(gòu) 最新研究表明，fUB作為CXCR4的另一內(nèi)源性配體，可能與SDF-1a/CXCR4具有同樣的心肌保護(hù)作用。在AMI，穩(wěn)定性心絞痛和不穩(wěn)定性心絞痛各40例患者中，血漿fUB 的mRNA和蛋白水平均有升高，且細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白水平升高。其中AMI患者中上升水平最高，提示fUB在冠心病進(jìn)展中發(fā)揮作用[36]。AMI后伴隨有交感神經(jīng)異常激活，兒茶酚胺大量釋放，作用于心臟β受體可通過(guò)GSK-3/JNK通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而PI3K/Akt通路可通過(guò)抑制GSK-3β活性發(fā)揮抗凋亡作用[37-38]。SINGH等[38]發(fā)現(xiàn)ISO(異丙腎上腺素)特異性激活成年大鼠心肌細(xì)胞的β受體可導(dǎo)致培養(yǎng)上清中fUB濃度升高，F(xiàn)SK直接刺激心肌細(xì)胞β受體下游的腺苷酸環(huán)化酶同樣可以升高細(xì)胞外泛素水平；CGP(β1受體阻斷劑)或ICI(β2受體阻斷劑)預(yù)處理30min后均可抑制ISO誘導(dǎo)的fUB濃度升高，說(shuō)明β1和β2受體均參與到升高fUB濃度；PI和Hoechst染色證實(shí)培養(yǎng)上清中fUB增多很可能是ISO處理后細(xì)胞主動(dòng)分泌所致，并非由于細(xì)胞膜通透性增加。10 μg/ml fUB預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min后，可完全逆轉(zhuǎn)ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。fUB的抗凋亡作用與抑制β受體激活后GSK-3β/JNK活性增高有關(guān)，且與增強(qiáng)抗凋亡通路PI3K/Akt活性有關(guān)[38]。由于PI3K/Akt可通過(guò)抑制 GSK-3β/JNK活性來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用，因此，細(xì)胞外泛素抗心肌細(xì)胞凋亡作用的直接作用分子需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

DANIELS等[39]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞外泛素可以抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)，降低纖維化，改善心功能。通過(guò)靜脈微滲透泵連續(xù)7天輸注ISO到小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)β受體激活所致心室重構(gòu)的小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)輸注fUB(fUB+ISO)。7天后對(duì)左室功能、形態(tài)和相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與ISO組相比，fUB+ISO組心肌細(xì)胞凋亡和組織纖維化程度均有明顯改善，心肌細(xì)胞肥大情況在兩組間無(wú)明顯差異。UB+ISO組同時(shí)具有較高水平的Akt活性，以及較低水平的GSK-3β和JNK活性。此外，UB+ISO可促進(jìn)MMP-2，MMP-9和TIMP-2的表達(dá)。分離培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞同樣在UB+ISO處理后出現(xiàn)高表達(dá)MMP-2和TIMP-2，抑制Akt活性則可阻斷該效應(yīng)[39]。MMPs主要降解膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，TIMPs是MMPs內(nèi)源性抑制分子，AMI后心臟組織中MMPs和TIMPs濃度失衡促進(jìn)過(guò)度纖維化及心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[40]。fUB促進(jìn)MMPs和TIMPs表達(dá)提示其可能在AMI后纖維化中發(fā)揮作用。

AMI后血管內(nèi)皮再生對(duì)于心肌組織的血供和瘢痕修復(fù)極為重要，適度的纖維瘢痕形成有助于維持組織完整性，而膠原過(guò)度沉積則導(dǎo)致心臟收縮舒張功能惡化[40]。大鼠中分離的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)fUB孵育處理后，VEGF-A和MMP-2表達(dá)均升高；細(xì)胞內(nèi)與遷移相關(guān)的纖維肌動(dòng)蛋白重排增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞向缺損處遷移及形成新生管狀物能力明顯提高，CXCR4受體特異性阻斷劑AMD3100可阻斷該效應(yīng)[41]。SCOFIELD等[42]證實(shí)心肌成纖維細(xì)胞上存在與fUB相互作用的CXCR4受體。在成纖維細(xì)胞中，fUB可激活ERK1/2并促進(jìn)VEGF表達(dá)。而與心肌細(xì)胞不同的是，fUB對(duì)Akt的表達(dá)或活性沒(méi)有影響；與內(nèi)皮細(xì)胞相反，fUB抑制胎牛血清誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和向損傷部位遷移。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)IDE(胰島素降解酶選擇性抑制劑)可將fUB(1-76)轉(zhuǎn)化為fUB(1-74)，具有抑制心肌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)作用[43]。AMI后缺血再灌注損傷小鼠模型中，給予fUB 3天后顯著降低梗死面積，提高心臟射血分?jǐn)?shù)，降低炎性滲出及中性粒細(xì)胞活性和聚集，降低血清中IL-12和MCP-1等炎癥因子水平[44]?？傊@些實(shí)驗(yàn)均提示，fUB/CXCR4對(duì)心臟內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)功能均有影響，且能減少AMI后缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)程度，因而可能參與到AMI心室重構(gòu)過(guò)程。

3結(jié)論與展望綜上所述，細(xì)胞外泛素及其受體CXCR4對(duì)心臟組織中的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等均有影響。在ISO誘導(dǎo)的心室重構(gòu)和AMI缺血再灌注損傷中，給予外源性fUB亦顯示出心臟保護(hù)功能，可以預(yù)想fUB作為CXCR4另一配體，將會(huì)成為治療AMI新的分子靶標(biāo)。由于fUB和SDF-1a具有共同受體CXCR4，且已有研究發(fā)現(xiàn)AMI后發(fā)生死亡，心衰或心梗復(fù)發(fā)的病人血清中有高水平SDF-1a，且SDF-1a可獨(dú)立預(yù)測(cè)AMI后危險(xiǎn)事件的發(fā)生[45]，未來(lái)還需進(jìn)一步明確檢測(cè)AMI患者血清中的fUB是否能對(duì)疾病早期診斷、病情評(píng)估和預(yù)后評(píng)估有作用。同時(shí)，闡明兩者在AMI中發(fā)揮功能的具體機(jī)制及相互作用，將進(jìn)一步加深對(duì)fUB生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，為AMI的發(fā)生發(fā)展及診療提供新的認(rèn)識(shí)和思路。另外，由于部分研究顯示受體CXCR4與α1-受體和β2-受體均有相互作用[46]，闡明與這些受體間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，必將進(jìn)一步揭示fUB發(fā)揮功能的具體信號(hào)通路，也為解決人類心血管疾病的難題帶來(lái)福音。