越橘提取物中花青素分析及其體外抗氧化活性

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(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,教育部食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457; 2.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心,天津 300457;3.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院,天津 300457)

越橘(Vacciniumvitis-idaeaLinn.),是杜鵑花科植物,原產(chǎn)于北美地區(qū)。目前,越橘在我國的東北及內(nèi)蒙古地區(qū)分布廣泛[1]。越橘含有豐富的生物活性成分,包括膳食纖維和多酚。據(jù)報(bào)道,富含多酚的越橘可以減少藍(lán)光誘導(dǎo)的小鼠的視網(wǎng)膜損傷[2]。越橘還具有抗氧化活性和酶抑制特性以及抗炎作用[3-4]。如今,越橘常用來制作飲料和釀酒,也用做食品中的著色劑[5]。除此之外,越橘還具有藥用價(jià)值,被歸類為功能性食品。越橘提取物是以成熟的越橘果實(shí)或加工殘?jiān)鼮樵咸崛〉玫降暮谧仙勰?其中花青素含量較高。越橘提取物功效優(yōu)良、應(yīng)用范圍廣、副作用低,如今已廣泛應(yīng)用于食品與藥品中[6]。

花青素屬于黃酮類化合物,是自然界廣泛存在的一類水溶性天然色素,廣泛存在于藍(lán)紫色果蔬中[7]。已有研究表明,花青素具有緩解視覺疲勞、改善動(dòng)物和人的視力、抗突變、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[8-14]。自然條件下很少有游離的花青素,其通常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷形成花色苷,存在于植物中的花青素主要有6種:矢車菊素、飛燕草素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素和錦葵素[15]。已有研究表明,越橘中花青素主要為錦葵素、飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素五種[16]。目前,主要使用液質(zhì)聯(lián)用法對花青素的各組分進(jìn)行鑒定。Tian等[17]通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對越橘中花青素進(jìn)行分離與鑒定,發(fā)現(xiàn)越橘中有矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷等。

本研究使用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對越橘提取物中的花青素進(jìn)行組分鑒定,并以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品,測定各組分的含量。同時(shí)對越橘提取物進(jìn)行了DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力和還原力的抗氧化活性分析,為越橘提取物的開發(fā)利用提供一定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

越橘提取物 尖峰天然產(chǎn)物有限公司;矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 純度>98%,USP(美國藥典);甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純;水 超純水;2,2′-聯(lián)氨-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;其他試劑 分析純。

Ultimate 3000 高效液相系統(tǒng) 美國安捷倫公司;amaZon SL離子阱質(zhì)譜儀 美國Bruker公司;A20高效液相系統(tǒng) 日本島津公司;EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;Milli-RO Plus超純水儀 美國Millipore公司;XC-3200DT超聲清洗機(jī) 天津歐諾儀器儀表有限公司;Thermo-C18固相萃取小柱、3020-679酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 越橘提取物中花青素的組成及含量分析

1.2.1.1 越橘提取物的純化 精密稱取越橘提取物10 mg(精確至0.01 mg),置于 10 mL容量瓶中,用 2%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到濃度為1 mg/mL的越橘提取物溶液。

Thermo-C18固相萃取小柱先分別用5 mL甲醇溶液和5 mL水溶液清洗活化,然后加入1 mL樣品溶液,抽真空至液體流盡,再用5 mL甲醇溶液洗脫,收集甲醇洗脫液。將收集的甲醇洗脫液進(jìn)行氮吹至甲醇完全吹干,用2%鹽酸-甲醇溶液復(fù)溶至1 mL,以備液質(zhì)測定。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取定量矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg)10 mg,置于10 mL容量瓶中,用2%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到濃度為1 mg/mL的矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,避光保存。

1.2.1.3 液相色譜及質(zhì)譜條件 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,高效液相色譜測定條件為:Ultimate 3000高效液相色譜儀,配紫外檢測器;色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:3%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:3%甲酸乙腈;梯度洗脫程序:0～35 min,7%～25% B;35～45 min,25%～65% B;45～46 min,65%～100% B;46～50 min,100% B;50～51 min,100%～7% B;51～60 min,7% B;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:530 nm。

質(zhì)譜條件:正離子模式,全自動(dòng)二級質(zhì)譜掃描,掃描范圍m/z 0～1000;霧化器壓力30 Psi;干燥氣(N2)流速8 L/min;溫度230 ℃;毛細(xì)管電壓3500 V。

1.2.2 越橘提取物的抗氧化能力

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力 稱取0.1984 g DPPH用無水甲醇溶解并定容至50 mL,配制成0.1 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液,越橘提取物用無水甲醇分別配制成10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液,準(zhǔn)確吸取不同濃度的1 mL越橘提取物溶液分別加入到3 mL 0.1 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液中,室溫避光30 min。以去離子水為參比溶液,VC為對照,每組設(shè)置3個(gè)平行,在517 nm下測定吸光度,根據(jù)式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率,并計(jì)算IC50,IC50越小,表示清除能力越強(qiáng)[18]。

式(1)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力 配制ABTS儲(chǔ)備液:10 mL 7 mmol/L的ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合,在室溫、避光條件下放置12～16 h,作為ABTS儲(chǔ)備液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)將儲(chǔ)備液稀釋至使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。越橘提取物用無水甲醇分別配制為10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液。

測定方法:準(zhǔn)確吸取不同濃度的1 mL越橘提取物溶液分別加入到4 mL ABTS溶液中,在30 ℃水浴中反應(yīng)6 min。以去離子水為參比溶液,以VC為對照,每組分別設(shè)置3個(gè)平行,在734 nm處測定吸光值,根據(jù)式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率,并計(jì)算IC50,IC50越小,表示清除能力越強(qiáng)[19]。

式(2)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.3 羥基自由基的清除能力 越橘提取物用無水甲醇配制成0.2、0.5、1.0、2.0及4.0 mg/mL的越橘提取物溶液。準(zhǔn)確吸取不同濃度的越橘提取物溶液各1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,充分搖勻,在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,以去離子水為參比溶液,以VC為對照,每組分別設(shè)置3個(gè)平行,在510 nm測定吸光值,根據(jù)式(3)計(jì)算羥基自由基清除率,并計(jì)算IC50,IC50越小,表示清除能力越強(qiáng)[20]。

式(3)

式中:A0:空白對照的吸光度值;Ai:加入樣品后的吸光度值;Aj:樣品本身的吸光度值。

1.2.2.4 還原力的測定 越橘提取物用無水甲醇配制成0、50、100、150、200及250 μg/mL的樣品溶液。準(zhǔn)確吸取不同濃度的越橘提取物溶液1 mL,依次加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,充分混勻,在50 ℃水浴中反應(yīng)30 min,快速冷卻,加入10%三氯乙酸2.5 mL,充分混勻,加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,充分搖勻,反應(yīng)10 min。以去離子水為參比,以VC為對照,在700 nm下測定吸光度值。還原力的大小用吸光度值來表示,吸光度值越大,表示還原力越強(qiáng)[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn),每個(gè)數(shù)據(jù)有三個(gè)重復(fù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件,采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 越橘提取物中花青素的組成及含量分析

2.1.1 越橘提取物中花青素的組成分析 通過HPLC-MS/MS對越橘提取物中花青素的組成進(jìn)行分析鑒定,得到液相色譜圖,見圖1。對色譜圖中的有效峰進(jìn)行質(zhì)譜分析得到含有不同質(zhì)荷比的分子離子峰和碎片離子峰,獲得化合物的分子量信息,并與文獻(xiàn)報(bào)道的組分相比較,推測出花青素組分,本文鑒定出越橘提取物中共有14種花青素,見表1。

表1 越橘提取物花青素分析Table 1 Anthocyanin analysis of bilberry extract

由圖1可以看出,越橘提取物中共檢測出14個(gè)花青素主峰,結(jié)合表1中的分子量可以發(fā)現(xiàn)越橘提取物含有5種花青素:飛燕草素(m/z 303),矢車菊素(m/z 287),矮牽牛素(m/z 317),芍藥素(m/z 301)和錦葵素(m/z 331)。

圖1 越橘提取物的液相色譜圖Fig.1 HPLC of bilberry extract

峰1和峰2具有相同的一級質(zhì)譜離子峰m/z 465和二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 303,其二級質(zhì)譜具有明顯的離子峰m/z 303,故可判斷其為飛燕草素衍生物。m/z 465與碎片離子峰m/z 303相差162,為飛燕草素丟失的中性碎片,其可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22-24]和兩種糖苷的洗脫順序?yàn)榘肴樘擒毡绕咸烟擒崭缦疵?因此可確定峰1為飛燕草素-3-O-半乳糖苷,峰2為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。同理,可以推測峰3為矢車菊素-3-O-半乳糖苷,峰5為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷,峰6為矮牽牛素-3-O-半乳糖苷,峰8為矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷,峰9為芍藥素-3-O-半乳糖苷,峰11為芍藥素-3-O-葡萄糖苷。

峰4的一級質(zhì)譜離子峰m/z 435和二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 303,可判斷為飛燕草素衍生物。m/z 435與碎片離子峰m/z 303相差132,表示丟失一個(gè)阿拉伯糖苷[25],因此可判斷峰4為飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷。同理,峰7為矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷。

由峰10的一級質(zhì)譜離子峰m/z 303,可推斷其為游離的飛燕草素。峰14的一級質(zhì)譜離子峰m/z 287,可判斷其為矢車菊素。

峰13的一級質(zhì)譜離子峰m/z 463,其二級質(zhì)譜離子峰MS/MS=m/z 331,其二級質(zhì)譜具有明顯的離子峰m/z 331,可判斷其為錦葵素類花青素,162表示母離子丟失一個(gè)葡萄糖苷,結(jié)合參考文獻(xiàn)[16]可確定峰13為錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷。

2.1.2 越橘提取物中花青素的含量分析

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 分別配制濃度為2、5、10、25、50、100 μg/mL的矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.1.3中色譜條件進(jìn)行測定。以矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到其峰面積與濃度有良好的線性關(guān)系,回歸方程y=58286x+67727,R2=0.9995。

2.1.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品按照1.2.1.3中色譜條件進(jìn)行測定,重復(fù)進(jìn)樣6次,測得色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.57%,表明在該色譜條件下精密度良好。

2.1.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取越橘提取物6份,按照1.2.1方法處理并進(jìn)行測定,測得越橘提取物中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的RSD為2.73%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 在已知含量的越橘提取物溶液中分別加入矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(5、10、25 μg/mL),連續(xù)進(jìn)樣三次,每次20 μL。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的平均回收率為99.14%,RSD為0.95%,表明該方法具有較高的加樣回收率。

2.1.2.5 越橘提取物中花青素的含量測定 以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)品,對越橘提取物的花青素進(jìn)行定量分析。通過對同一化合物不同的異構(gòu)體的峰面積加合起來進(jìn)行總量的計(jì)算,結(jié)果表示為均值±SD μg(矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量)/mg(越橘提取物)[26]?；ㄇ嗨馗鹘M分的含量見表2。

表2 越橘提取物中花青素各組分的含量Table 2 Content of anthocyanins in bilberry extract

經(jīng)計(jì)算,越橘提取物中花青素的總含量為408.74 μg/mg。其中,矢車菊素類花青素含量最高,為159.93 μg/mg,占總含量的39.12%。

2.2 越橘提取物的抗氧化能力分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果,如圖2所示。在濃度為10～50 μg/mL范圍內(nèi),越橘提取物的DPPH自由基清除率從22.26%增加到了86.09%。在每個(gè)濃度下,越橘提取物的DPPH自由基清除率都低于VC的,VC的濃度為20 μg/mL時(shí),DPPH清除率就達(dá)到95%以上,并且在之后趨于平穩(wěn)。經(jīng)計(jì)算,越橘提取物和VC的DPPH清除率的IC50分別為26.16和7.35 μg/mL。根據(jù)IC50可知越橘提取物有良好的DPPH清除能力,但相對于VC較弱。

圖2 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.2 ABTS自由基清除能力 越橘提取物和VC的ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果,如圖3所示。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都呈現(xiàn)增長的趨勢。在相同的質(zhì)量濃度下,越橘提取物清除ABTS自由基的能力強(qiáng)于VC。當(dāng)濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí),越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都達(dá)到90%以上,并且在之后趨于平穩(wěn),并接近100%。經(jīng)計(jì)算,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率的IC50分別為13.07和15.55 μg/mL。根據(jù)IC50可知,越橘提取物有強(qiáng)于VC的ABTS自由基清除能力。

圖3 越橘提取物和VC的ABTS+自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.3 羥基自由基清除能力 羥基自由基(·OH)是活性氧類物質(zhì)中化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種自由基,其在自由基病理學(xué)上具有高度損傷性,它的損傷能力幾乎在每一個(gè)活細(xì)胞內(nèi)都能發(fā)生,是危害最大一種最大的自由基[27]。越橘提取物和VC清除羥基自由基的結(jié)果見圖4。如圖4所示,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),越橘提取物的羥基自由基清除率隨濃度的增加而增加,清除率從15.43%增加到90.27%。同時(shí),VC在濃度為1.0 mg/mL時(shí),清除率就達(dá)到99%,并且在之后接近100%。經(jīng)計(jì)算,越橘提取物和VC的羥基自由基清除率的IC50分別為1.91和0.48 mg/mL。根據(jù)IC50可知,越橘提取物有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力,但是相對于VC較弱。

圖4 越橘提取物和VC的羥基自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.4 還原力 常用還原鐵氰化鉀的方法來測定還原力的大小,抗氧化劑可以將Fe3+還原成Fe2+,測定700 nm處的吸光度值可以反映Fe2+數(shù)量,來代表還原力的大小[28]。越橘提取物和VC的還原力如圖5所示。由圖5可知,越橘提取物和VC的還原能力都隨濃度增大而增大。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),越橘提取物的還原力從0.043增加到0.617,而VC對照的還原力從0.043增加到1.162,且在相同濃度下,越橘提取物的還原力低于VC。

圖5 越橘提取物和VC的還原力Fig.5 The reducing power of bilberry extract and VC

3 結(jié)論

本文通過HPLC-MS/MS鑒定出越橘提取物中含有14種花青素,分別為飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-半乳糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素和矢車菊素。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)品,得到越橘提取物中總花青素含量為408.74 μg/mg。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,越橘提取物有良好的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原力,但相比于VC較弱,其ABTS自由基清除能力強(qiáng)于VC。本研究可以為進(jìn)一步開發(fā)越橘類功能性產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。