明黨參中游離氨基酸與核苷類成分的同時(shí)測(cè)定及品質(zhì)評(píng)價(jià)

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(1.常州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇常州 213003; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

明黨參(ChangiumsmyrnioidesWollf)是我國(guó)華東地區(qū)特有的傘形科多年生草本植物[1-2]。其根部經(jīng)燙煮、去皮等處理后即為藥材明黨參,可用于治療肺熱咳嗽、嘔吐反胃、食少口干、目赤眩暈、疔毒瘡瘍等癥[3];除藥用外,亦常作滋補(bǔ)品食用[4]。明黨參藥材及植株各部位含有揮發(fā)油、多糖、不飽和脂肪酸、香豆素、膽堿等多種化學(xué)成分,具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗凝血等藥理作用[5-8]。其中,氨基酸和核苷類物質(zhì)與明黨參補(bǔ)益功能相關(guān),可為生命活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng),許多成分如精氨酸、鳥苷、腺苷等,又具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等藥理作用[6,9],此外,味覺氨基酸還影響明黨參的呈味。

國(guó)內(nèi)外研究主要采用高效液相色譜法、全自動(dòng)氨基酸分析儀法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定氨基酸含量[10-16]。其中高效液相色譜法可利用紫外檢測(cè)器直接檢測(cè),但需先進(jìn)行柱前衍生化處理。全自動(dòng)氨基酸分析儀具有較固定的測(cè)定規(guī)程,但周期相對(duì)較長(zhǎng),一般需50 min以上。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定快速、便捷,但需根據(jù)具體樣品調(diào)整色譜和質(zhì)譜條件。核苷類成分主要采用高效液相色譜法測(cè)定,多以甲醇-水、甲醇-磷酸或乙腈-甲酸為流動(dòng)相[17-19]。前期研究?jī)H對(duì)明黨參新鮮根部和炮制品中氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,已測(cè)得18種游離氨基酸[11-13],但尚未對(duì)根以外部分及組織培養(yǎng)材料進(jìn)行研究,亦未見對(duì)其中核苷類成分的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)選取已報(bào)道的18種游離氨基酸中人體蛋白質(zhì)組分氨基酸和藥用氨基酸共計(jì)11種為游離氨基酸測(cè)定指標(biāo),同時(shí),選取11種與生命代謝和發(fā)揮藥理作用相關(guān)的常見核苷與堿基作為核苷類測(cè)定指標(biāo)。本研究運(yùn)用超快速液相色譜-四極桿離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法(UFLC-Qtrap-MS/MS)同時(shí)、快速檢測(cè)明黨參葉、柄、根以及組織培養(yǎng)物中11種游離氨基酸和11種核苷類成分,從游離氨基酸與核苷角度揭示不同樣品的品質(zhì)差異,為進(jìn)一步合理利用明黨參資源提供啟示與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明黨參植株 采集于南京中醫(yī)藥大學(xué)仙林校區(qū)藥苑,分揀出葉、柄和根;明黨參組織培養(yǎng)材料 獲取自前期實(shí)驗(yàn)[20-21],其中再生小植株先由愈傷組織誘出叢生芽[22],再在含1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤的培養(yǎng)基上繼代一次后轉(zhuǎn)至含1.0 mg/Lα-萘乙酸的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根而得,收獲小植株并分揀出葉、柄和根;11種氨基酸和11種核苷對(duì)照品:脯氨酸(批號(hào):B21914)、纈氨酸(批號(hào):B21936)、亮氨酸(批號(hào):B21925)、天冬氨酸(批號(hào):B21934)、谷氨酸(批號(hào):B21916)、賴氨酸(批號(hào):B21922)、甲硫氨酸(批號(hào):B21913)、組氨酸(批號(hào):B21938)、苯丙氨酸(批號(hào):B21910)、精氨酸(批號(hào):B21920)、酪氨酸(批號(hào):B21924)、尿嘧啶(批號(hào):100469-200401)、腺嘌呤(批號(hào):110886-200001)、次黃嘌呤(批號(hào):B20211)、鳥嘌呤(批號(hào):140631-200904)、胸苷(批號(hào):1001182663)、胞苷(批號(hào):100982718)、尿苷(批號(hào):887-200202)、2′-脫氧鳥苷(批號(hào):1000943454)、腺苷(批號(hào):110879-200202)、肌苷(批號(hào):40669-201104)、鳥苷(批號(hào):1001103046) 純度均大于98%,上海源葉生物科技有限公司;甲酸 色譜純,德國(guó)默克公司;乙腈 色譜純,德國(guó)默克公司。

ABSciex QTRAP 5500質(zhì)譜儀 美國(guó)ABSciex公司;LC-20A快速液相儀 日本島津公司;BT125D十萬分之一電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;ME36S百萬分之一電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;KH-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;TGL-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Milli-Q Direct 8超純水儀 德國(guó)默克密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取22種對(duì)照品,用純水配制成對(duì)照品母液。精密吸取各母液2 mL,用純水定容至50 mL,得到混合對(duì)照品母液,其中各對(duì)照品濃度見表2。

1.2.2 供試品溶液制備 明黨參樣品經(jīng)冷凍干燥,研粉,過四號(hào)篩,稱取樣品粉末1.0000 g,置50 mL錐形瓶,加20 mL超純水,于室溫下超聲(100 kHz)提取1 h,過濾,濾液在12000 r·min-1離心10 min,取上清液1 mL,加超純水定容至10 mL,過0.22 μm微孔濾膜后備用。

1.2.3 色譜條件 采用Waters XBridge Amide(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為0.2%甲酸(A)-0.2%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脫(0～2.5 min,15% A;2.5～5 min,15～50% A;5～7 min,50% A;7～8 min,50～15% A;8～11 min,15% A)[19]。流速為0.6 mL·min-1,進(jìn)樣量為2 μL,柱溫為30 ℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring,MRM)進(jìn)行正離子檢測(cè),氣簾氣壓35 psi,Gas1氣壓55 psi,Gas2氣壓55 psi,溫度550 ℃,噴霧電壓為5500 V。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限 取1.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品母液,逐級(jí)稀釋成一系列混合對(duì)照品溶液,分別過0.22 μm微孔濾膜后備用。精密吸取不同濃度的混合對(duì)照品溶液分別于1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸,確定回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍,檢測(cè)限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別取信噪比S/N=3和S/N=10進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液,于1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各成分6次峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6.2 重復(fù)性考察 稱取6份明黨參樣品(A1),按1.2.2項(xiàng)所述制備成供試品溶液,在1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定,以峰面積計(jì)算6份樣品測(cè)定結(jié)果RSD值。

1.2.6.3 穩(wěn)定性考察 稱取明黨參樣品(A1),按1.2.2項(xiàng)所述制備成供試品溶液,在1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下,于0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定,以峰面積計(jì)算6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果的RSD值。

1.2.6.4 加樣回收率考察 稱取明黨參樣品(A3),精密加入高、中、低3個(gè)水平的對(duì)照品,每一水平3次重復(fù),共9份。按1.2.2項(xiàng)所述制備供試品溶液并在1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以峰面積計(jì)算回收率及RSD值。

1.2.7 明黨參樣品測(cè)定 將明黨參樣品按1.2.2項(xiàng)所述制成供試品溶液,于1.2.3和1.2.4項(xiàng)所述色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,每一樣品重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算樣品中氨基酸和核苷類成分含量,利用Excel統(tǒng)計(jì)樣品中測(cè)得的游離氨基酸和核苷類成分總數(shù)量與總含量、人體必需氨基酸數(shù)量和味覺氨基酸含量,并進(jìn)行逼近理想點(diǎn)排序(technique for order preference by similarity to an ideal solution,TOPSIS)。應(yīng)用SPSS Statistics 22.0分別進(jìn)行樣品中氨基酸和核苷類成分的主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱溫(27、30、35 ℃)、流動(dòng)相流速(0.4、0.6、0.8 mL·min-1)和質(zhì)譜MRM參數(shù)進(jìn)行了考察,結(jié)果表明柱溫30 ℃,流動(dòng)相流速0.6 mL·min-1時(shí)各成分分離效果最佳,各成分保留時(shí)間和優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表1。

表1 待測(cè)成分保留時(shí)間和MRM參數(shù)Table 1 Retention time and MRM parameters of component to be tested

續(xù)表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限

22種待測(cè)成分線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限見表2,各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均不低于0.9973,表明所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠。

表2 待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限Table 2 Standard curves,LOD and LOQ of component to be tested

2.3 方法學(xué)考察

本實(shí)驗(yàn)所建方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率考察結(jié)果見表3,RSD值均小于5%,回收率均在98.62%～100.64%之間,表明儀器精密度、方法重復(fù)性和待測(cè)成分穩(wěn)定性良好,該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

表3 方法學(xué)考察結(jié)果Table 3 Results of methodological evaluation

2.4 氨基酸類成分分析

2.4.1 氨基酸總含量與種類分析 實(shí)驗(yàn)測(cè)得明黨參樣品中游離氨基酸種類及總含量分別如圖1和圖2所示。原植物葉、柄、根和再生植株葉、柄中氨基酸種類較多,說明該類成分隨著細(xì)胞分化程度的增高而積累。但再生根中種類較少,僅檢出3種,相比原植物根大大減少,這可能由兩者結(jié)構(gòu)、功能上的差異所致。氨基酸類成分組成及含量見表4。栽培品多年生根外形膨大,為重要的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏器官,檢出5種人體必需氨基酸,而組培再生根較細(xì)弱,主要發(fā)揮固著植株和吸收營(yíng)養(yǎng)的功能。游離氨基酸總含量的最低值(葉愈傷組織)和最高值(葉柄懸浮細(xì)胞)均存在于脫分化狀態(tài)的培養(yǎng)樣品中。該類成分在植物體內(nèi)既是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),又在某些條件下發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)功能,如脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等[23-25],懸浮細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),相較于愈傷組織其環(huán)境滲透壓改變較大,細(xì)胞相應(yīng)產(chǎn)生更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),這可能是導(dǎo)致該樣品游離氨基酸總量高的原因之一。

圖1 明黨參樣品中氨基酸類成分種類Fig.1 Total numbers of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples注:A1-原植物葉;A2-原植物柄;A3-原植物根;B1-再生植株葉;B2-再生植株柄;B3-再生植株根;C1-葉源愈傷組織;C2-柄源愈傷組織;D1-葉源懸浮細(xì)胞;D2-柄源懸浮細(xì)胞；圖2～圖5同。

圖2 明黨參樣品中氨基酸類成分總含量Fig.2 Total contents of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

表4 樣品中氨基酸類成分含量(μg·g-1)Table 4 Contents of amino acids in samples(μg·g-1)

2.4.2 氨基酸類主成分分析 明黨參各樣品中游離氨基酸含量經(jīng)降維分析,以特征值>1,方差貢獻(xiàn)率>5%,累積貢獻(xiàn)率>70%為標(biāo)準(zhǔn),選取了4個(gè)主成分(表5),累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.888%,各主成分對(duì)氨基酸指標(biāo)的載荷和評(píng)分系數(shù)見表6。F1主要反映谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和組氨酸信息,F2反映甲硫氨酸和亮氨酸含量,F3代表苯丙氨酸和天冬氨酸,F4代表酪氨酸和纈氨酸。計(jì)算四個(gè)主成分得分并進(jìn)一步通過各自方差貢獻(xiàn)率的權(quán)重計(jì)算出各樣品中氨基酸類成分的綜合評(píng)分F值,F=0.404F1+0.258F2+0.187F3+0.151F4(表7)。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,以游離氨基酸為指標(biāo),明黨參栽培品根品質(zhì)最佳,其次為離體培養(yǎng)再生葉。

表5 氨基酸類主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of amino acids

表6 氨基酸類主成分載荷和評(píng)分系數(shù)Table 6 Factor load and score coefficient matrix of principal components of amino acids

表7 氨基酸類主成分得分和綜合評(píng)價(jià)Table 7 Principal component score and comprehensive evaluation of amino acids

2.4.3 味覺氨基酸分析 將明黨參樣品中的氨基酸歸為甜、苦、鮮和芳香四類[26-27],其分布如圖3所示。四類味覺氨基酸在不同樣品中含量差異較大,其中,原植物葉和柄懸浮細(xì)胞中四者分布較為均衡,其余離體培養(yǎng)樣品大多缺失一些類別的味覺氨基酸。原植物根中含較多苦味和甜味氨基酸,是藥材明黨參“味甘、微苦”[3]的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。甜味、鮮味和芳香類氨基酸最高含量均存在于柄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,該培養(yǎng)材料生長(zhǎng)狀況也較為旺盛[20],提示著其為味覺氨基酸的一種可利用資源。再生葉和柄中含有較多的甜味及苦味氨基酸。明黨參由于種子萌發(fā)率低、自然競(jìng)爭(zhēng)力較弱等原因?qū)е缕鋵?shí)生苗較難獲得[28-30],而組培再生芽易于獲得,具有一定的芽菜開發(fā)價(jià)值。

圖3 明黨參樣品中味覺氨基酸含量Fig.3 Contents of taste-active amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5 核苷類成分分析

2.5.1 核苷總含量與種類分析 明黨參樣品中測(cè)得核苷類成分總數(shù)量與總含量分別如圖4和圖5所示,核苷類成分具體含量見表8。分化器官中核苷種類數(shù)總體稍稍多于脫分化樣品,其中以原植物葉中種類最多,但核苷類總含量方面呈現(xiàn)出相反趨勢(shì),脫分化細(xì)胞中總含量高于分化器官,其中柄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中總含量最高,說明脫分化培養(yǎng)狀態(tài)雖然可能缺失對(duì)個(gè)別核苷類成分如次黃嘌呤、腺嘌呤的積累,但利于其他核苷成分如鳥苷、腺苷的大量積累。該類成分多具有抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜等藥理作用[9,18],提示著明黨參愈傷組織、懸浮細(xì)胞等脫分化的培養(yǎng)材料為此類成分的潛在資源。

表8 樣品中核苷類成分含量(μg·g-1)Table 8 Contents of nucleosides in samples(μg·g-1)

圖4 明黨參樣品中核苷類成分種類Fig.4 Total numbers of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

圖5 明黨參樣品中核苷類成分總含量Fig.5 Total contents of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5.2 核苷類主成分分析 明黨參樣品中核苷類成分含量經(jīng)降維分析,以特征值>1,方差貢獻(xiàn)率>5%,累積貢獻(xiàn)率>70%為標(biāo)準(zhǔn),選取了3個(gè)主成分(表9),累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.001%,各主成分對(duì)核苷類指標(biāo)的載荷和評(píng)分系數(shù)見表10。F1主要反映鳥苷、鳥嘌呤、尿苷、尿嘧啶和腺苷的信息,F2主要代表2′-脫氧鳥苷、肌苷、腺嘌呤和胸苷,F3代表胞苷。計(jì)算三個(gè)主成分得分,并進(jìn)一步算出10種樣品中核苷類成分的綜合評(píng)分F值,F=0.467F1+0.338F2+0.195F3(表11)。結(jié)果顯示,以核苷類成分為指標(biāo),明黨參柄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞品質(zhì)最佳,其次為原植物葉。結(jié)合表8可見,F1中的腺苷與鳥苷含量在所有樣品中均明顯高于其他成分,腺苷具降血壓、抗血小板聚集、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、調(diào)節(jié)睡眠等功能[31-32],鳥苷具免疫調(diào)節(jié)、防心律失常、改善心腦血液循環(huán)等作用[9,33],柄懸浮細(xì)胞中這兩者含量也尤為突出,可結(jié)合發(fā)酵工程以積累腺苷與鳥苷成分為目標(biāo)對(duì)該懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)一步研究。原植物葉為藥材采收時(shí)被大量廢棄的部分,亦可作為核苷類資源合理利用。

表9 核苷類主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 9 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of nucleosides

表10 核苷類主成分載荷和評(píng)分系數(shù)Table 10 Factor load and score coefficient matrix of principal components of nucleosides

表11 核苷類主成分得分和綜合評(píng)價(jià)Table 11 Principal component score and comprehensive evaluation of nucleosides

2.6 基于TOPSIS法的綜合評(píng)價(jià)

表12 明黨參樣品TOPSIS分析結(jié)果Table 12 Result of TOPSIS evaluation for Changium smyrnioides Wollf samples

3 結(jié)論

本研究建立了以UFLC-Qtrap-MS/MS同時(shí)檢測(cè)明黨參原植物及其組培樣品中11種游離氨基酸與11種核苷類成分的方法。22種成分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率考察RSD值均小于5%,平均加樣回收率在98.62%～100.64%之間,表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠,可供明黨參中11種游離氨基酸與11種核苷的同時(shí)、快速測(cè)定。

不同狀態(tài)的明黨參樣品中游離氨基酸與核苷類成分有一定差異。原植物和再生植株中成分種類較多,而懸浮細(xì)胞中總含量較高。柄懸浮細(xì)胞中所測(cè)11種游離氨基酸與11種核苷總含量均為最高,分別為3682.01、6241.90 μg·g-1,該樣品中味覺氨基酸含量豐富,其中甜味和鮮味氨基酸含量也居所有樣品首位。主成分分析顯示以游離氨基酸為指標(biāo),原植物根品質(zhì)最佳,其次為再生葉;以核苷類成分為指標(biāo),柄懸浮細(xì)胞品質(zhì)最佳,其次為原植物葉。TOPSIS法綜合兩類成分進(jìn)行評(píng)定認(rèn)為柄懸浮細(xì)胞最優(yōu),其次為原植物根。由此可見,明黨參傳統(tǒng)藥食兩用的根部、被廢棄的葉片和利用組培技術(shù)獲得的再生葉、柄懸浮細(xì)胞均具有與氨基酸和核苷相關(guān)的開發(fā)價(jià)值,該結(jié)果為明黨參資源的合理利用提供參考。