超聲波輔助提取玫瑰茄多糖工藝研究

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350003）

植物多糖具有抗血栓、降血糖[1]、增強(qiáng)免疫力[2]、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]等多種生物學(xué)功能[5]，因此成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。植物多糖提取方法主要有超濾法、溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[6]。其中超聲波輔助提取多糖具有時(shí)間短、節(jié)約成本[7]、提取速度快、溶劑消耗少、提取效率高、操作簡(jiǎn)便及對(duì)天然產(chǎn)物破壞少等優(yōu)點(diǎn)[8]，目前廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取[9]。

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花（roselle）、洛神葵、山茄等[10]，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物[11]。玫瑰茄廣泛生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)廣東、廣西、云南、福建等有栽培[12]。玫瑰茄花萼可藥食兩用，含有豐富的維生素C、維生素E、氨基酸、蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)[13]、酚酸類、類黃酮類、花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]，具有抗癌、抗高血糖、降血脂、抗炎癥、改善消化系統(tǒng)等藥理作用[15-16]。玫瑰茄花青素提取研究近年來(lái)漸有報(bào)道[17]，但未見玫瑰茄多糖相關(guān)報(bào)道。本文以玫瑰茄干花萼為原料，以玫瑰茄多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取玫瑰茄多糖工藝，為玫瑰茄進(jìn)一步開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄：市售；D-無(wú)水葡萄糖：美國(guó)Sigma；濃硫酸、乙醇、苯酚、氯仿：試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHF-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；AB204-N型電子天平：上海上平儀器有限公司；Alpha-1502紫外可見分光光度計(jì)、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海譜元儀器有限公司；LGR10-4.2高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；As-BDT超聲波清洗器：天津奧特塞恩斯儀器有限公司。

1.3 玫瑰茄多糖的測(cè)定方法

1.3.1 樣品處理

挑選色澤明亮并剔除傷爛病蟲花萼的玫瑰茄，用清水洗凈玫瑰茄，切開花的底部，頂出果核后在烘箱內(nèi)60℃烘干12 h，然后進(jìn)行粉碎。粉碎后密封保存。

1.3.2 玫瑰茄多糖提取工藝流程

玫瑰茄多糖提取采用水浸醇析法提取。將烘干的玫瑰茄粉碎過(guò)篩，超聲波輔助提取，提取液抽濾除雜，濃縮至原體積1/3，按體積比1∶4加入80%乙醇，冷凍離心10 min，反復(fù)多次收集沉淀，得玫瑰茄多糖與蛋白質(zhì)混合物，沉淀用蒸餾水溶解，活性炭脫色后，用Sevage試劑（正丁醇 ∶氯仿=4∶1，mL/mL），脫蛋白 5次，將上清液定容至100 mL容量瓶中，搖勻得玫瑰茄多糖提取液[18]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖[19]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.500 mg/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 7 個(gè) 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻。再分別精確吸取上述溶液2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入1.0 mL苯酚溶液（6%），搖勻后加入5.0 mL濃硫酸，迅速搖勻后靜置30 min，以蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

1.3.4 多糖提取率的計(jì)算

精確吸取4.0 mL玫瑰茄多糖提取液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度[21]。其計(jì)算公式為：

式中：C為玫瑰茄多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為玫瑰茄多糖提取液定容的體積，mL；M為玫瑰茄干粉質(zhì)量，g。

1.4 方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)

以水為提取液，選擇固液比、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素，以多糖提取率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定固液比，超聲波功率，提取溫度和提取時(shí)間為主要影響因素，以玫瑰茄提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件和Excel2016軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=6.982 1x+0.000 5，R2=0.999 6，式中：x為葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；y為吸光度，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

結(jié)果表明葡萄糖在質(zhì)量濃度0.00mg/mL～0.06mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 固液比對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響

在提取溫度40℃、超聲波功率210 W、提取時(shí)間10 min的條件下，探討固液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）時(shí)，玫瑰茄多糖提取率隨著溶液體積增大而增加，在1∶20（g/mL）處達(dá)到最大，其后多糖提取率反而下降，總體上低溶液體積提取率高于高溶液體積提取率。其原因是隨著溶液體積增大，溶劑用量增加，多糖浸出率隨之增大，但當(dāng)溶劑用量增加到一定值時(shí)，超聲波輻射被溶劑大量吸收，溶劑溶解雜質(zhì)也增多，而不能完全作用于樣品。因此，選取固液比 1 ∶10、1 ∶15、1∶20（g/mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 固液比對(duì)玫瑰茄多糖提取率影響Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on extraction efficiency

2.2.2 超聲波功率對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比1∶20（g/mL）、提取溫度40℃、提取時(shí)間10 min的條件下，探討超聲波功率對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲波功率對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power extraction efficiency

由圖3可知，隨著超聲波功率的升高，多糖提取率先增加后降低，當(dāng)超聲波功率達(dá)到270 W時(shí)，提取率最高。其原因是機(jī)械作用隨著超聲波功率增大而增強(qiáng)，分子擴(kuò)散速度增大，多糖浸出率增大，雜質(zhì)也增多。因此，選取240、270、300 W進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比為1∶20（g/mL）、提取溫度40℃、超聲波功率270 W的條件下，探討提取時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on extraction efficiency

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率先升高后下降，以30 min為界點(diǎn)，30 min前提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而升高，30 min后提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而下降，其原因是長(zhǎng)時(shí)間提取會(huì)使多糖分子在空化作用和機(jī)械作用下發(fā)生降解和破壞，使雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，選取30、40、50 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 提取溫度對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比為 1∶20（g/mL）、超聲波功率 270 W、提取時(shí)間 30 min的條件下，探討提取溫度 40、50、60、70、80℃對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖5可知，當(dāng)溫度達(dá)60℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，溫度再升高多糖提取率反而下降，其原因是溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，多糖容易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到溶質(zhì)中，但是溫度過(guò)高，部分多糖化合物容易被氧化破壞，會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)，不利于后續(xù)的分離。因此，選取50、60、70℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)

按1.4.2方法來(lái)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，得玫瑰茄多糖最佳提取工藝參數(shù)，并考察各因素對(duì)玫瑰茄多糖提取率影響的主次順序。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology

續(xù)表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 2 Orthogonal test results of extraction technology

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

由表2極差分析得出，各因素對(duì)玫瑰茄多糖提取率影響主次順序依次為固液比（A）＞超聲波功率（B）＞提取時(shí)間（C）＞提取溫度（D）。由表3方差分析檢驗(yàn)可知，固液比、超聲波功率和提取時(shí)間達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說(shuō)明上述三因素對(duì)玫瑰茄多糖提取率有顯著影響。因此，玫瑰茄多糖提取最佳工藝為：A3B2C1D2，即超聲波功率為270 W，固液比1∶20（g/mL），提取溫度為60℃，提取時(shí)間為30 min。在此條件下，玫瑰茄多糖提取率最高。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)可知，試驗(yàn)結(jié)果最好的方案為A3B2C1D2，而正交表中沒(méi)有該方案組合，為進(jìn)一步考察上述提取工藝結(jié)果的準(zhǔn)確性，按照最優(yōu)組合A3B2C1D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測(cè)定5次，取平均值，測(cè)得玫瑰茄多糖平均提取率為56.66%，大于正交試驗(yàn)結(jié)果中多糖最高提取率52.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值為0.47%），表明該方法重復(fù)性良好，適合玫瑰茄多糖提取。

2.5 提取次數(shù)對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響

設(shè)超聲波功率270 W，提取時(shí)間為30 min，固液比為 1 ∶20（g/mL），提取溫度為 60 ℃，分別提取 1、2、3次，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，多糖提取率隨提取次數(shù)增加而提高，提取3次，提取率最大。但增加提取次數(shù)不但多糖提取率變化不大，還會(huì)導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出，為了節(jié)約成本，提取次數(shù)以2次為宜。

圖6 提取次數(shù)對(duì)玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.6 The effect of extraction times on extraction efficiency

3 結(jié)論

超聲波輔助提取玫瑰茄多糖高效可行，工藝簡(jiǎn)單，其影響因素主次順序?yàn)楣桃罕龋境暡üβ剩咎崛r(shí)間＞提取溫度。工藝參數(shù)為超聲波功率270 W，提取溫度 60℃，固液比 1∶20（g/mL），提取時(shí)間 30 min，提取2次。在此條件下，玫瑰茄多糖提取率最高，為60.35%。

超聲波輔助提取作為一種先進(jìn)的提取方法，通過(guò)超聲波對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生的破碎效應(yīng)，從而可以提高了提取成分的效率，是一種高效、快速、環(huán)保的提取方法。超聲波提取技術(shù)應(yīng)用于玫瑰茄多糖的提取，具有省時(shí)、高效、節(jié)能、穿透力強(qiáng)、選擇性高、有效成分溶出快等特點(diǎn)。更重要的是提取過(guò)程避免高溫，從而預(yù)防因高溫對(duì)玫瑰茄多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞，為玫瑰茄多糖提取實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，對(duì)充分利用玫瑰茄資源有現(xiàn)實(shí)參考意義。