郭偉峰,王紅梅,鄒曉桐,羅秀秀,王萍,曾霞,尹愛(ài)國(guó),周英彪,*
(1.廣東石油化工學(xué)院廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,廣東普通高校食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),廣東茂名525000;2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東茂名525000)
桑葚(Fru ctus mori)又叫桑果、桑椹、桑椹子、桑葚子,是桑樹所結(jié)的果實(shí),味甘性寒,歸心、肝、腎經(jīng),具有滋陰補(bǔ)血、生津止渴、補(bǔ)肝益腎等功效[1]。桑葚果汁色澤艷麗,且富含維生素、胡蘿卜素、黃酮醇、花青素、酚酸等多種生物活性物質(zhì),具有良好的保健功能[2]。目前對(duì)桑葚的加工形式有干果[3]、果汁[4]、復(fù)合飲料[5]、果酒[6-8]及果醋[9-11]等。
酵素按用途可分為食用酵素、環(huán)保酵素、日化酵素及飼用酵素。其中,食用酵素是指以動(dòng)物、植物及菌類為原料,經(jīng)微生物發(fā)酵而制得具有特定生物活性成分可食用的產(chǎn)品[12]。其中生物活性成分對(duì)生物現(xiàn)象有影響的微量或少量物質(zhì),包括多糖類、寡糖類、蛋白質(zhì)、酶及多肽類、氨基酸類、維生素類、及醇、酯、酸、酚類等[13]。進(jìn)行桑葚酵素的研究開(kāi)發(fā),可以豐富桑葚的深加工形成,滿足市場(chǎng)需求。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是重要的生物活性因子,在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用,在醫(yī)藥、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)上均有廣泛的應(yīng)用前景[14-16]。SOD酶活力是優(yōu)化酵素發(fā)酵工藝的常用指標(biāo)之一,此類的研究報(bào)道較多。如利用SOD酶活力作為指標(biāo),劉鑫等優(yōu)化了藍(lán)莓酵素發(fā)酵工藝[17],馮彥君等優(yōu)化了藍(lán)莓酵素發(fā)酵工藝[18],韋仕靜等優(yōu)化了西蘭花酵素發(fā)酵工藝[19]。
近年來(lái),對(duì)桑葚酵素的研究開(kāi)發(fā)也有報(bào)道。如Kwaw E等[20]以總酚為指標(biāo),優(yōu)化了利用乳酸桿菌發(fā)酵桑葚果汁制備桑葚酵素飲料的工藝;韋仕靜等[21]以桑葚干果粉混合蘋果汁為原料,乳酸桿菌為發(fā)酵菌株,總酸與總糖為指標(biāo),優(yōu)化了桑葚酵素的發(fā)酵工藝。本研究以桑葚果汁為原料,SOD酶活力為指標(biāo),先從釀酒酵母、醋酸桿菌及植物乳酸桿3種種屬中優(yōu)選出合適菌種組合,然后單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝,并對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝下制得的桑葚酵素飲料做了質(zhì)量評(píng)價(jià)。
1.1.1 原料、菌株與培養(yǎng)基
1.1.1.1 原料
桑葚(Fructusmori),產(chǎn)自廣東省化州市。
1.1.1.2 菌株
釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,CGMCC2.3853):中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus,CICC 20064) 及植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum,CICC 21790):中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
1.1.1.3 培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g,酵母粉 5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。YPD培養(yǎng)基:蛋白胨20 g,酵母粉 10 g,葡萄糖 20 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.0。
1.2.1 主要試劑
鄰苯三酚:國(guó)藥集團(tuán);其他試劑分析純。
1.2.2 主要儀器
WJS1222F型榨汁機(jī):廣東美的電器股份有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國(guó)華電器有限公司;DHZ-DA型臥式恒溫?fù)u床:蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YP10002型電子天平:上海佑科上海佑科儀器儀表有限公司;Gene 1580R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Gene Company Limited),及L5S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海儀電科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 桑葚酵素飲料的工藝流程
桑葚酵素飲料的工藝流程如圖1所示。
圖1 桑葚酵素飲料的工藝流程Fig.1 The process of the mulberry ferment beverage
包括桑葚分選、桑葚榨汁、桑葚果汁調(diào)配、菌種培養(yǎng)與洗滌、桑葚果汁純菌體接種、發(fā)酵、發(fā)酵液靜置2 h澄清、8 000 r/min 離心 10 min、0.45 μm 濾膜過(guò)濾、質(zhì)量檢測(cè)、分裝等工序。
1.3.2 原料的預(yù)處理
將-20℃冰箱保藏的桑葚轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中24 h,使結(jié)冰完全融化,于榨汁機(jī)中榨汁,純桑葚榨汁不加水,榨汁后加入終濃度0.2 g/L偏重亞硫酸鉀防氧化。桑葚果汁裝瓶封口,-20℃冰箱保存,試驗(yàn)前在4℃冰箱中解凍24 h。
1.3.3 菌株培養(yǎng)與洗滌
釀酒酵母(YPD培養(yǎng)基,30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng))、醋酸桿菌(LB培養(yǎng)基,30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng))與植物乳酸桿菌(LB培養(yǎng)基,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng))培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期,分別按接種量取培養(yǎng)液,離心去除培養(yǎng)基,無(wú)菌水洗滌菌體2次后,菌體接入桑葚果汁進(jìn)行發(fā)酵。
1.3.4 SOD酶活力測(cè)定
采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定桑葚果汁及桑葚酵素樣品的SOD酶活力[22-23]。
鄰苯三酚的自氧化速率測(cè)定:在試管中加入4.00mL蒸餾水、4.50 mL PBS(phosphate buffer saline)緩沖液(pH 8.3、50 mmol/L)、1.00 mL EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)溶液(10 mmol/L),混勻,25 ℃平衡20 min;然后加入0.50 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L、25℃預(yù)熱),迅速搖勻,立即傾入比色杯中,在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值,每隔30 s讀數(shù)一次,測(cè)定4 min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化速率??瞻讓?duì)照為4.00 mL蒸餾水、4.50 mL PBS緩沖液(pH 8.3、50 mmol/L)、1.00 mL EDTA溶液(10 mmol/L)混合0.50 mL HCl(10 mmol/L)。
樣品光密度值變化速率測(cè)定:桑葚果汁及桑葚酵素樣品8 000 r/min、離心10 min,取上清液稀釋10倍。在試管中加入0.20 mL稀釋后的樣品、3.80 mL蒸餾水、4.50 mL PBS 緩沖液(pH 8.3、50 mmol/L)、1.00 mL EDTA 溶液(10 mmol/L),混勻,25℃平衡 20 min;然后加入0.50 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L、25℃預(yù)熱),迅速搖勻,立即傾入比色杯中,在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值,每隔30 s讀數(shù)一次,測(cè)定4 min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化速率??瞻讓?duì)照同前。
式中:V1為反應(yīng)液總體積,mL;V2為測(cè)定樣品體積,mL;n為樣品稀釋液倍數(shù);ODA為鄰苯三酚的自氧化速率;ODB為樣品光密度值變化速率。
1.3.5 確定最佳發(fā)酵菌種
設(shè)置7個(gè)菌種組合:植物乳酸桿菌、醋酸桿菌、釀酒酵母、植物乳酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+醋酸桿菌、醋酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+醋酸桿菌+釀酒酵母;菌株組合體積比例為1∶1和1∶1∶1。桑葚果汁量為120 mL,調(diào)初始糖度為6 Brix,接種量為5%(菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體),發(fā)酵溫度設(shè)置為30℃,180 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為48 h。取樣測(cè)定各個(gè)菌株組合發(fā)酵液的單位SOD酶活力(每組測(cè)3個(gè)平行樣),比較其顯著性,選單位SOD酶活力最高的菌種組合進(jìn)行進(jìn)一步探究。
1.3.6 單因素試驗(yàn)
選取確定最佳發(fā)酵菌種試驗(yàn)中發(fā)酵液?jiǎn)挝籗OD酶活力最高的菌種組合作為桑葚酵素的發(fā)酵菌種,進(jìn)行發(fā)酵溫度、接種量、初始糖度及發(fā)酵時(shí)間等單因素試驗(yàn),以單位SOD酶活力為指標(biāo),研究各因素對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響。
1.3.6.1 發(fā)酵溫度
發(fā)酵溫度設(shè)置為 26、28、30、32、34、36 ℃共 6 個(gè)水平。桑葚果汁量為120 mL,初始糖度為6 Brix,接種量為10%(菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體),180 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為24 h。取樣測(cè)定各個(gè)水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力(每水平測(cè)3個(gè)平行樣),t-檢驗(yàn)比較其顯著性。
1.3.6.2 接種量
接種量設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%、30%共6個(gè)水平(菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體)。桑葚果汁量為120 mL,初始糖度為6 Brix,發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗(yàn)中的最優(yōu)發(fā)酵溫度,180 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為24 h。取樣測(cè)定各個(gè)水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力(每水平測(cè)3個(gè)平行樣),比較其顯著性。
1.3.6.3 初始糖度
用白砂糖調(diào)節(jié)桑葚果汁初始糖度為6、10、14、18、22、26 Brix共6個(gè)水平。桑葚果汁量為120 mL,接種量設(shè)置為接種量因素試驗(yàn)中的最優(yōu)接種量(菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體),發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗(yàn)中的最優(yōu)發(fā)酵溫度,180 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為24 h。取樣測(cè)定各個(gè)水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力(每水平測(cè)3個(gè)平行樣),t-檢驗(yàn)比較其顯著性。
1.3.6.4 發(fā)酵時(shí)間
發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為 8、16、24、32、40、48 h 共 6 個(gè)水平。桑葚果汁量為120 mL,初始糖度為初始糖度因素試驗(yàn)中的最優(yōu)初始糖度,接種量設(shè)置為接種量因素試驗(yàn)中的最優(yōu)接種量(菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體),發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗(yàn)中的最優(yōu)發(fā)酵溫度,180 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為24 h。取樣測(cè)定各個(gè)水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力(每水平測(cè)3個(gè)平行樣),t-檢驗(yàn)比較其顯著性。
1.3.7 正交試驗(yàn)
依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取發(fā)酵溫度、接種量、初始糖度及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素各3個(gè)顯著水平,進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),以桑葚酵素中單位SOD酶活力為指標(biāo),確定最優(yōu)桑葚酵素發(fā)酵工藝。
1.3.8 質(zhì)量評(píng)價(jià)
采用優(yōu)化所得的發(fā)酵條件,按桑葚酵素飲料的工藝流程制備葚酵素飲料,參照GB/T 10789-2015《飲料通則》[24]、GB/T 31121-2014《果蔬汁類及其飲料》[25]、及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)桑葚酵素飲料的感官、理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.3.9 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理與分析,組間差異比較采用t-檢驗(yàn)方法。
7個(gè)菌種組合發(fā)酵所得桑葚酵素,均沒(méi)有異味,風(fēng)味上均可以接受。菌種對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響見(jiàn)圖2。
圖2 菌種對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.2 Effect on mulberry ferment with fermentation strain
由圖2可知,與單位SOD酶活力最低的(釀酒酵母)比較,植物乳酸桿菌、醋酸桿菌、植物乳酸桿+菌醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的差異極為顯著(p<0.01),植物乳酸桿菌+釀酒酵母、醋酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+釀酒酵母+醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的差異顯著(p<0.05),說(shuō)明發(fā)酵菌種對(duì)桑葚酵素的發(fā)酵有明顯影響。其中,以醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的桑葚酵素單位SOD酶活力(19 146.2 U/mL)最高,因此選取醋酸桿菌為發(fā)酵菌種,進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2.1 發(fā)酵溫度
酵溫度對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響見(jiàn)圖3。
由圖3可知,在初始糖度為6 Brix、發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、接種量為10%、發(fā)酵時(shí)間24 h情況下,發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響;隨著發(fā)酵溫度的升高桑葚酵素的單位酶活力逐漸升高,當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)單位酶活力達(dá)到最高,當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí),單位酶活力明顯下降。因此選取28、30、32℃此3個(gè)發(fā)酵溫度水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。
圖3 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.3 Effect on mulberry ferment with ermentation temperature
2.2.2 接種量
接種量對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響見(jiàn)圖4。
圖4 接種量對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.4 Effect on mulberry ferment with inoculum
由圖4可知,在初始糖度為6 Brix、發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間24 h情況下,接種量對(duì)桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響;接種量為5%時(shí)桑葚酵素的單位酶活力較低,隨著菌種接種量的提高單位酶活力逐漸升高,當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)單位酶活力達(dá)到最高,接種量超過(guò)10%單位酶活力開(kāi)始明顯下降。因此選取5%、10%、15%此3個(gè)接種量水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.3 初始糖度
初始糖度對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響見(jiàn)圖5。
由圖5可知,在發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間24 h情況下,初始糖度對(duì)桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響;初始糖度為6Brix時(shí),桑葚酵素的單位酶活力較低,隨著初始糖度的提高單位酶活力逐漸升高,初始糖度達(dá)到14 Brix時(shí)桑葚酵素的單位酶活力達(dá)到最高,超過(guò)14 Brix后,單位酶活力開(kāi)始逐漸下降。因此選取10 Brix、14 Brix、18 Brix此3個(gè)初始糖度水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。
圖5 初始糖度對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.5 Effect on mulberry ferment with initial sugar content
2.2.4 發(fā)酵時(shí)間
發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響見(jiàn)圖6。
圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.6 Effect on mulberry ferment with fermentation time
由圖6可知,在發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、初始糖度為6 Brix、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃情況下,初始糖度對(duì)桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響;桑葚酵素的單位SOD酶活力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),呈先升高后降低的趨勢(shì),發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí),桑葚酵素的單位SOD酶活力達(dá)最高。因此選取16、24、32 h此3個(gè)發(fā)酵時(shí)間水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。
依單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取A發(fā)酵溫度(28、30、32℃)、B 發(fā)酵時(shí)間(16、24、32 h)、C 初始糖度(10、14、18 Brix)及D接種量(5%、10%、15%)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。結(jié)果如表1所示。
表1 桑葚酵素發(fā)酵L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9(34)
續(xù)表1 桑葚酵素發(fā)酵L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9(34)
桑葚酵素發(fā)酵的A發(fā)酵溫度、B發(fā)酵時(shí)間、C初始糖度及D醋酸菌接種量4個(gè)因素的極差(R)表現(xiàn)為:RA(1587.3)>RC(673.4)>RD(423.9)>RB(336.7),因此影響桑葚酵素發(fā)酵的主次影響因素依次為發(fā)酵溫度、初始糖度、醋酸菌接種量、發(fā)酵時(shí)間。
k1、k2、k3分別為各因素各水平所對(duì)應(yīng)的單位SOD酶活力的平均值,由表2可知,在 A 因素中,k2>k3>k1;在 B 因素中,k2>k1>k3;在 C 因素中,k2>k3>k1;在 D 因素中,k2>k3>k1。因此,各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序是:A2>A3>A1,B2>B1>B3,C2>C3>C1,D2>D3>D1;由此可得出荔枝酵素發(fā)酵工藝的最優(yōu)方案為A2B2C2D2。
綜合分析,最終確定桑葚酵素發(fā)酵工藝為:發(fā)酵溫度為30℃、初始糖度14 Brix、醋酸菌接種量為10%、發(fā)酵時(shí)間為24 h。在此工藝條件下,3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為,桑葚酵素的SOD酶活力為24 122.2 U/mL,大于正交試驗(yàn)中的最大值23 088 U/mL。
2.4.1 桑葚酵素飲料的感官指標(biāo)
桑葚酵素飲料感官指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 桑葚酵素飲料的感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluation of the mulberry ferment beverage
結(jié)果表明,以桑葚為原料采用最佳發(fā)酵工藝釀制的桑葚酵素飲料色澤紫紅鮮艷,酸味柔和,口感上佳,體態(tài)透明清澈無(wú)沉淀,具有桑葚果香和醋香。該桑葚酵素飲料感官指標(biāo)符合及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
2.4.2 桑葚果汁與桑葚酵素飲料理化成分指標(biāo)比較
對(duì)桑葚酵素飲料中SOD酶活、總酸、總糖、還原糖進(jìn)行測(cè)定,得到桑葚酵素飲料的理化指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 桑葚果汁與桑葚酵素飲料的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of the mulberry juice and the mulberry ferment beverage
桑葚酵素飲料的SOD酶活力為24 122.2 U/mL,比較于桑葚果汁的SOD酶活力(10 818.7 U/mL)提高了123%;總酸為(3.82±0.08)g/L,總糖為(5.37±0.08)%,還原糖為(2.154±0.016)%,符合 GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
2.4.3 桑葚酵素飲料的微生物指標(biāo)
桑葚酵素飲料微生物指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 桑葚酵素飲料的微生物指標(biāo)Table 4 Microbial indicators of the mulberry ferment beverage
表4表明桑葚酵素飲料微生物指標(biāo)符合GB/T 31121-2014《果蔬汁類及其飲料》[25]及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
本研究以桑葚果汁為原料,SOD酶活力為指標(biāo),先從釀酒酵母、醋酸桿菌及植物乳酸桿3種種屬中優(yōu)選出合適菌種組合,然后單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝。
優(yōu)化后的桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝為:發(fā)酵菌種為醋酸菌,初始糖度14 Brix,接種量10%,發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間24 h;此工藝條件下制備的桑葚酵素飲料的SOD酶活力達(dá)24 122.2 U/mL,比桑葚果汁的SOD酶活力(10 818.7 U/mL)提高了123%;桑葚酵素飲料色澤紫紅鮮艷,酸味柔和,口感上佳,體態(tài)透明清澈無(wú)沉淀,具有桑葚果香和醋香,其感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。