不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠腸道菌群的影響

王藝苑，林姍姍，熱依拉·阿巴拜克熱，陳珊珊，陳潔華，鄧紅

（南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，廣東廣州510515）

低聚糖俗稱寡糖，是由2個(gè)～10個(gè)同種或不同種單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的低質(zhì)量小聚合體。按照生物學(xué)功能可分為普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖因不可被消化大多進(jìn)入消化道后端被腸道菌群發(fā)酵利用，從而誘導(dǎo)雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌增殖，減少大腸桿菌等有害菌定植，調(diào)節(jié)腸道pH值的功能[1-3]。

普通人體腸道內(nèi)蘊(yùn)藏著龐大的菌群系統(tǒng)，它們的基因總量是我們?nèi)梭w自身基因的100倍以上[4]，并因機(jī)體生理狀態(tài)、飲食習(xí)慣、遺傳、年齡處于動(dòng)態(tài)平衡中[5]，且對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)、防癌抗病等方面起調(diào)節(jié)作用[6]。膳食改變是影響腸道菌群種類及豐度最重要也較為快速直接的方法。低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）作為一種由葡萄糖和乳糖組成的低聚糖可經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)有益菌群擴(kuò)增，常作為益生元添加到嬰幼兒奶粉中以彌補(bǔ)非母乳喂養(yǎng)造成的腸道菌群失衡的負(fù)面影響[7-8]，目前低聚果糖（fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS）的研究已有很多，然而低聚半乳糖的攝入推薦量文獻(xiàn)報(bào)道沒有統(tǒng)一的結(jié)論[9]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)初斷乳大鼠飲食中添加不同濃度的低聚半乳糖，研究其作為益生元添加到大鼠飼料中對(duì)腸道結(jié)構(gòu)、形態(tài)功能的影響以及對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，并與普通飼料組及添加10%低聚果糖試驗(yàn)組相比較，以期為低聚半乳糖營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料

30只3周齡雄性初斷乳SD大鼠，體重（40±5）g：南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK2016-0041。各試驗(yàn)組大鼠飼料根據(jù)AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料配方調(diào)整，將纖維素分別并用不同濃度的低聚半乳糖或低聚果糖代替，制作質(zhì)量濃度0%低聚半乳糖添加飼料（0%GOS），5%低聚半乳糖添加飼料（5%GOS），10%低聚半乳糖添加飼料（10%GOS），10%低聚果糖添加飼料（10%FOS），普通AIN-93G飼料（AIN 93），其中10%低聚果糖為陽(yáng)性對(duì)照，AIN-93G為普通飼料對(duì)照。飼料組分：深圳睿迪生物科技有限公司，飼料配方見表1。

表1 飼料組成成分表Table 1 Compositions of the experimental diets g/kg

1.2 試劑與儀器

低聚半乳糖GOS（82.8%）：英國(guó)BimunoTM公司；低聚果糖 FOS（92.7%，Synergy1）：比利時(shí) Beneo公司；4%多聚甲醛溶液：廣州Panera生物有限公司；HE染色液（蘇木素/伊紅）試劑盒：湖北白奧斯生物科技有限公司；其余試劑為分析純。

YP10001電子天平：常州衡正電子儀器有限公司；IX73倒置顯微鏡：日本 OLYMPUS公司；Modell RM2135石蠟切片機(jī)：德國(guó)Leica公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分組及干預(yù)

30只初斷乳大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照體重隨機(jī)分為0%低聚半乳糖組、5%低聚半乳糖組、10%低聚半乳糖組、10%低聚果糖組、普通飼料飼喂組，并投喂相應(yīng)種類的飼料。大鼠單籠飼養(yǎng)在清潔動(dòng)物房不銹鋼籠中，采用塑料飲水瓶自由給水，溫度控制在22℃～25℃，濕度控制在45%～60%，每日給予光照12 h，室內(nèi)循環(huán)換氣。每天下午4：00定時(shí)收集大鼠糞便，稱重記錄后于-80℃冰箱中保存。記錄大鼠起始體重及每日進(jìn)食量，每2 d對(duì)大鼠體重進(jìn)行稱重記錄，計(jì)算體重增加量。

1.3.2 組織樣本制備

連續(xù)干預(yù)14 d，每組大鼠禁食12 h后，用10%水合氯醛麻醉后，分別取空腸、盲腸，于4℃生理鹽水中漂洗干凈腸道內(nèi)容物后，取中間1 cm小段于4%多聚甲醛中常溫下充分固定，剩余部分放入凍存管中，迅速放入液氮，之后-80℃保存。取盲腸稱重，用無(wú)菌手術(shù)刀剖開后，一次性藥勺刮取盲腸內(nèi)容物分存于凍存管中，-80℃保存。

1.3.3 組織學(xué)檢查

經(jīng)4%多聚甲醛充分固定的組織塊在梯度酒精中進(jìn)行脫水處理，然后將脫水的組織透明處理，依次經(jīng)過(guò)浸蠟、包埋、修快、切片和粘片步驟，而后用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、及蘇木精-伊紅乙醇染色，染好色的切片用中性樹膠封片，觀察。用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像采集處理系統(tǒng)采圖，測(cè)量回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

1.3.4 腸道菌群檢測(cè)

采用糞便DNA提取試劑盒提取腸道菌群細(xì)菌基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，質(zhì)控合格后，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1ng/μL。對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，采用正向引物341F和反向引物806R進(jìn)行V3+V4區(qū)擴(kuò)增。正向引物序列為 341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，反向引物序列為 806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。送至北京諾禾生物股份有限公司，PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，后根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的Life Ion S5TM或Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。使用Cutadapt軟件過(guò)濾和按barcode拆分樣本后，對(duì)所有樣本的Clean reads以97%的一致性進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚糖類益生元對(duì)初斷乳大鼠體重及糞便的影響

體重增長(zhǎng)趨勢(shì)見圖1。

試驗(yàn)前各組大鼠體重基本相同，14d干預(yù)后大鼠體重出現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)，其中10%GOS組增長(zhǎng)量最少，普通組增長(zhǎng)量最大，10%FOS組與普通組接近，但差異均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。根據(jù)圖1，各組增長(zhǎng)趨勢(shì)相近。

圖1 體重增長(zhǎng)趨勢(shì)圖Fig.1 Body weight growth trend

不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠糞便質(zhì)量的影響見圖2。

圖2 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠糞便質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different concentration of galacto-oligosaccharide on the weight of fecal feces

肉眼觀察，各試驗(yàn)組大鼠糞便形態(tài)顏色等有明顯差異，0%GOS組糞便色黑質(zhì)硬，形狀短圓，普通組糞便色灰白質(zhì)稀疏，形狀多呈規(guī)則橢圓，添加益生元類組糞便呈現(xiàn)棕黃色，質(zhì)濕軟形態(tài)呈長(zhǎng)條狀。糞便總質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.01），0%GOS組與其余各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5%GOS組與10%GOS組無(wú)差異，10%FOS與普通組間無(wú)差異，其余各組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

不同濃度的低聚半乳糖作為益生元添加到大鼠每日飼料中未影響到大鼠的進(jìn)食量及體重增長(zhǎng)情況，干預(yù)期內(nèi)大鼠毛發(fā)光澤，喜活動(dòng)，精神狀態(tài)良好。目前研究普遍認(rèn)為低聚糖類益生元具有增加糞便含水量及體積從而軟化糞便，改善便秘的作用[10-11]，元添加組的糞便量較空白組有所增加，其中10%GOS組比5%GOS組的促排便能力要強(qiáng)，推測(cè)低聚半乳糖對(duì)便秘調(diào)節(jié)功能主要是依靠食物的物理吸水性來(lái)增加糞便體積及腸道的潤(rùn)滑程度，并與菌群改變與發(fā)酵產(chǎn)物有一定關(guān)系。

2.2 低聚糖類益生元對(duì)初斷乳大鼠肝臟及盲腸質(zhì)量的影響

不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠肝臟及盲腸質(zhì)量的影響見表2。

表2 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠肝臟及盲腸質(zhì)量的影響（±s）Table 2 Effects of different concentrations of galactooligosaccharide on the weight of liver and cecum in the newly weaned rats（±s）

表2 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠肝臟及盲腸質(zhì)量的影響（±s）Table 2 Effects of different concentrations of galactooligosaccharide on the weight of liver and cecum in the newly weaned rats（±s）

注：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重，盲腸指數(shù)=盲腸質(zhì)量/體重。標(biāo)號(hào)表示相比較時(shí)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：a與0%GOS組相比；b與10%FOS組相比；c與 AIN 93 組相比，p＜0.01。

組別 肝臟質(zhì)量/g 肝臟指數(shù)/% 盲腸質(zhì)量/g 盲腸指數(shù)/%0%GOS 10.42±1.10 7.02±0.69 1.73±0.48a 1.19±0.39a 5%GOS 8.42±3.04 5.82±1.73 3.97±1.11ab 2.76±0.51ab 10%GOS 8.68±0.91 6.43±0.64 6.85±1.51c 5.08±1.10c 10%FOS 9.74±1.15 6.51±0.54 6.06±1.78c 4.05±1.11c AIN 93 9.32±1.83 6.37±1.49 1.67±0.21a 1.11±0.17a

各試驗(yàn)組肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)有不同，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。盲腸質(zhì)量有顯著差異（p＜0.01），其中0%GOS組與普通組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，與其他各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），10%GOS組盲腸質(zhì)量最大（見表2）。

病理檢查研究發(fā)現(xiàn)，各組大鼠臟器變化不大，但空腸、盲腸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其盲腸差異巨大，補(bǔ)充低聚糖類益生元組的盲腸體積、質(zhì)量、盲腸內(nèi)容物質(zhì)量均發(fā)生顯著變化，其中10%GOS體積和質(zhì)量最大，分析原因，可能與低聚糖類益生元在腸道內(nèi)雖不能被消化吸收卻可以經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，改變腸道酸堿環(huán)境有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)與杭蘇琴早先發(fā)表果寡糖對(duì)于仔豬腸道形態(tài)變化研究結(jié)果類似，F(xiàn)OS組仔豬小腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度之比均高于對(duì)照組，且胃腸道內(nèi)有機(jī)酸增高顯著[13]。

2.3 低聚糖類益生元對(duì)初斷乳大鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響見表3。

各組大鼠空腸的絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度比值無(wú)明顯變化，其中，表3可見，0%GOS組低于其他試驗(yàn)組及普通飼料組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盲腸絨毛高度有明顯變化，其中0%GOS組最短，10%GOS組最長(zhǎng)，低聚糖添加組較普通組有所增長(zhǎng)。盲腸絨毛高度/隱窩深度的比值亦存在0%GOS組最低，且結(jié)果又統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。

表3 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響（±s）Table 3 Effects of different concentration of galacto-oligosaccharide on intestinal villi height and crypt depth in newly weaned rats（±s）μm

表3 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響（±s）Table 3 Effects of different concentration of galacto-oligosaccharide on intestinal villi height and crypt depth in newly weaned rats（±s）μm

注：標(biāo)號(hào)表示相比較時(shí)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：a與0%GOS組相比；b與AIN 93組相比，p＜0.01，x與0%GOS組相比，p＜0.05。

項(xiàng)目 0%GOS 5%GOS 10%GOS 10%FOS AIN 93空腸絨毛高度 240.58±30.64 258.25±20.97 249.92±35.61 258.39±31.60 258.82±40.03空腸隱窩深度 150.43±18.84 153.17±17.09 152.23±26.18 152.83±13.03 153.02±19.98空腸絨毛高度/隱窩深度 1.61±0.15 1.70±0.20 1.64±0.25 1.68±0.16 1.69±0.21盲腸絨毛高度 139.31±14.62 205.31±20.44a 216.13±27.63a 209.96±20.13a 194.91±23.59a盲腸隱窩深度 33.35±7.72 25.40±11.72 23.49±9.85 27.03±9.59 21.08±6.13盲腸絨毛高度/隱窩深度 4.41±4.46 9.77±4.50 10.71±4.84x 8.81±3.80 10.19±4.04x盲腸肌層厚度 226.99±56.11 167.72±50.85ab 163.35±49.63ab 165.50±20.34ab 268.43±50.13

不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠盲腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響見圖3。

顯微鏡下觀察腸道切片形態(tài)，空腸處各組干預(yù)組變化不大，但盲腸的絨毛高度有顯著差異（見圖3），較0%GOS組，各組均明顯升高（p＜0.01）。絨毛高度的升高及絨毛高度/隱窩深度的比值增大表明腸道具有更強(qiáng)的吸收能力，因此盲腸器質(zhì)類改變表明功能狀態(tài)的改變，低聚半乳糖的增加干預(yù)誘導(dǎo)刺激了絨毛的增長(zhǎng)，使腸道吸收能力更優(yōu)，其可能與某些文獻(xiàn)中報(bào)道的低聚糖類益生元類物質(zhì)增加鈣、鐵、鎂等礦物質(zhì)有關(guān)[11，14-15]。

2.4 低聚糖類益生元對(duì)初斷乳大鼠腸道菌群的影響

不同低聚半乳糖組腸道菌群排名前10的菌種相對(duì)豐富度見圖4A。

不同低聚半乳糖組腸道菌群雙歧桿菌與乳酸桿菌相對(duì)豐富度見圖4B。

聚類分析后選取試驗(yàn)組在屬分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形圖（圖4A），可直觀查看到低聚糖添加飼料中雙歧桿菌及乳酸桿菌的組分明顯增加，其中10%GOS組增加最明顯，甚至優(yōu)于10%FOS陽(yáng)性對(duì)照組（圖4B）。

圖3 不同濃度低聚半乳糖對(duì)初斷乳大鼠盲腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響（HE染色，100倍放大）Fig.3 Effects of different concentrations of galacto-oligosaccharide on the structure and morphology of cecum in newly weaned rats（HE，100X）

圖4 不同低聚半乳糖組腸道菌群物種相對(duì)豐富度柱形圖Fig.4 Histogram of relative abundance of intestinal microbiome in different galacto-oligosaccharide groups

圖5 不同低聚半乳糖組腸道菌群PCoA圖Fig.5 Principal co-ordinates analysis of intestinal microbiome distribution in different galacto-oligosaccharide groups

不同低聚半乳糖組腸道菌群分布主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）見圖5。

基于Weighted Unifrac距離來(lái)進(jìn)行主距離分析PCoA，如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。由圖5可見，各組不同干預(yù)組大鼠的腸道菌群的群落分布差異明顯，低聚糖添加組多聚集在一起，即菌群結(jié)構(gòu)相似。

不同低聚半乳糖濃度組雙歧桿菌豐度MetaStat分布見圖6。

進(jìn)一步篩選組間具有顯著性差異的物種并繪制差異物種在組間的豐度分布箱圖（圖6）。下圖顯示在雙歧桿菌種屬下各組的差異，0%GOS組與其余濃度低聚糖添加組均有差異，且（p＜0.01），普通組與低聚糖組也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.01），其中10%GOS對(duì)于雙歧桿菌的增長(zhǎng)作用最顯著。

目前，越來(lái)越多的研究表明腸道菌群的穩(wěn)態(tài)與人體健康息息相關(guān)，它與心腦血管疾病、代謝性疾病，胃腸道炎癥及自身免疫綜合征等疾病的關(guān)系也在層層揭開[16-17]。本研究通過(guò)細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)擴(kuò)增后，對(duì)高變區(qū)V3V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序及菌種測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，低聚半乳糖添加組中雙歧桿菌與乳酸桿菌的增殖較空白對(duì)照及普通對(duì)照發(fā)生明顯升高，其中10%GOS組對(duì)于促進(jìn)益生菌增殖作用最顯著，致使大鼠腸道菌群組成出現(xiàn)差異。即從物種豐度前十的相對(duì)豐富度上看，低聚半乳糖添加組的雙歧桿菌與乳酸桿菌顯著增多。雙歧桿菌與乳酸桿菌作為人體內(nèi)組成優(yōu)勢(shì)菌的有益菌群，其豐度和分布占據(jù)著重要作用，一旦兩者數(shù)量增多可抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜菌等條件致病菌的增殖[18]。低聚果糖的雙歧因子作用在改善腸道菌群方面已獲得較多較全面研究[19-20]，從PCoA圖可以看到添加了低聚糖類益生元的組別相距較近說(shuō)明物種差異不大，但是進(jìn)一步關(guān)注組間差異性物種，5%、10%低聚半乳糖組改善腸道菌群的能力相較于10%低聚果糖的陽(yáng)性對(duì)照組也存在一定優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖對(duì)于雙歧桿菌的增殖效果更顯著。

圖6 不同低聚半乳糖濃度組雙歧桿菌豐度MetaStat分布Fig.6 MetaStat distribution of bifidobacteria in different galactooligosaccharide concentration groups

3 結(jié)論

低聚半乳糖的添加可在一定程度上改善大鼠的腸道吸收能力，并有效促進(jìn)腸道中雙歧桿菌與乳酸桿菌的增殖，并且高濃度低聚半乳糖的添加可以更顯著的改善腸道菌群。5%、10%低聚半乳糖組改善腸道菌群的能力相較于10%FOS存在一定優(yōu)勢(shì)。