IL-6對(duì)RAW264.7細(xì)胞成熟分化的體外實(shí)驗(yàn)研究

王信 張怡 陳萍 季文軍 馬亞萍 敖俊,* 張軍,*

1. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，貴州 遵義 563000 2. 遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563000 3. 遵義醫(yī)學(xué)院-羅切斯特大學(xué)骨科研究中心，貴州 遵義 563000

白介素-6(Interleukin-6，IL-6)作為一種多功能細(xì)胞因子，在人體內(nèi)含量甚微，對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)具有雙重作用：既可以通過結(jié)合IL-6特異性受體，激活Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT3、PI3K等信號(hào)通路發(fā)揮破骨效應(yīng)；又可以促進(jìn)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶、骨鈣素等表達(dá)，從而加強(qiáng)骨基質(zhì)的礦化形成[1]。在我們前期實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)了100 ng/mL骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)和IL-6聯(lián)合抑制小鼠單核-巨噬細(xì)胞的成熟和分化[2]。本次實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度的IL-6因子直接對(duì)破骨細(xì)胞分化和破骨功能的影響是否存在濃度依賴性，從而為今后防治骨質(zhì)疏松癥提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 方法和材料

1.1 主要試劑

實(shí)驗(yàn)選用小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科惠贈(zèng)；小鼠重組sRANKL購于美國PeproTech公司，用無菌PBS溶液將其配制為工作濃度為50 ng/mL的溶液；IL-6試劑購于PeproTech公司，使用時(shí)用無菌PBS溶液將其稀釋成工作濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL的液體。胎牛血清購于美國GIBCO公司；DEME高糖培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；TRAP染色試劑盒購于美國Simga公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，溫度控制于37 ℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液。取出細(xì)胞種植入無菌六孔板中，單用50 ng/mL RANKL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞1 d后，分為4組，1空白對(duì)照組(1 mL 50 ng/mL RANKL + PBS 1 mL)、2低濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 50 ng/mL IL-6)、3中濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 100 ng/mL IL-6)、4高濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 150 ng/mL IL-6)。分別向各組中加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)至第9天，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：

1.2.2HE染色

蓋玻片經(jīng)濃硫酸過夜浸泡、沖洗并消毒處理后，放置于6孔板中，待上述細(xì)胞完成80%以上的細(xì)胞爬片后，進(jìn)行HE組織染色，，每組選用3個(gè)蓋玻片進(jìn)行觀察成熟破骨細(xì)胞的染色情況，每個(gè)蓋玻片采集5個(gè)不同的視野。采用光鏡下測量成熟破骨細(xì)胞生成數(shù)，主要是根據(jù)破骨細(xì)胞核的多核細(xì)胞(超過3個(gè)細(xì)胞核)形成數(shù)量來判定成熟破骨細(xì)胞生成量。

1.2.3TRAP特異性染色

細(xì)胞如同上述方法處理，參照試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色，經(jīng)過TRAP染色后，成熟破骨細(xì)胞胞漿被染成典型的玫瑰紅，細(xì)胞核則會(huì)被蘇木精染成深藍(lán)或藍(lán)紫色。通過倒置顯微鏡下采集圖像后，經(jīng)圖像分析軟件測量玫瑰紅色細(xì)胞漿在每個(gè)高倍鏡視野下所占的累計(jì)面積，每組分別采集3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本采集5個(gè)不同的視野，求得平均值，計(jì)算其占視野面積的百分比。

1.2.4骨片掃描電鏡檢查

取新鮮小鼠顱骨，制成面積為1 cm×1 cm，厚度約65 μm左右的薄骨片，清洗4-5次/20 min，用以去除多余的軟組織。然后，將其置于4 ℃冰箱保存。使用前取出浸泡在75%酒精過夜后，并暴露在紫外線照射8 h以上。以1×107個(gè)/孔接種RAW264.7細(xì)胞于每個(gè)薄骨片上，予以50 ng/mL RANKL干預(yù)1 d后，如上述方法繼續(xù)用不同濃度的IL-6刺激和培養(yǎng)9 d，無菌PBS沖洗，戊二醛和鋨酸雙固定后、酒精梯度脫水，CO2真空干燥，鍍金，掃描電鏡觀察骨吸收陷窩形成情況。采用圖像分析軟件對(duì)上述各組骨吸收陷窩面積進(jìn)行計(jì)算，統(tǒng)計(jì)各組3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本5個(gè)不同視野進(jìn)行陷窩面積的計(jì)算，求得平均值，計(jì)算其占視野面積的百分比。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖像采集Leica(FX-BUSRS232C)顯微鏡、Nikon倒置熒光顯微鏡，圖像分析利用Image Pro-Plus 6.0軟件，統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 10.0版軟件，組間比較應(yīng)用方差分析的方法，P值<0.05判斷為差異有顯著性。數(shù)據(jù)表達(dá)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差形式。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

空白對(duì)照組中的破骨細(xì)胞，在RANKL的刺激下細(xì)胞胞體明顯增大，胞質(zhì)豐富，可見細(xì)胞間融合現(xiàn)象，有典型多核形成表現(xiàn)。低濃度IL-6組中仍可見少許成熟破骨細(xì)胞形成，并隨著濃度的增高，多核形成不明顯(如圖1)。經(jīng)過光鏡計(jì)數(shù)，成熟破骨細(xì)胞生成數(shù)量結(jié)果如下：空白對(duì)照組152.50±35.24；IL-6組中分別為 120.8±18.89、66.5±17.23、35.25±19.0。中和高濃度IL-6組明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 HE染色下各組破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化A：空白對(duì)照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.1 The morphological changes of osteoclast cells in HE staining (×200)A: Control group; B: 50 ng/mL IL-6 group; C: 100 ng/mL IL-6 group; D: 150 ng/mL IL-6 group

2.2 TRAP染色結(jié)果

50ng/mL RANKL處理的空白對(duì)照組，胞質(zhì)染色明顯較深，陽性染色面積區(qū)域大；低和中濃度IL-6組偶見陽性染色區(qū)域，且面積較小和少，僅可見少許粉紅色區(qū)域；高濃度IL-6組中，染色更淺，比較難找到陽性染色區(qū)域(如圖2)。通過倒置相差顯微鏡采集圖像，經(jīng)圖像分析軟件測量其區(qū)域面積，空白對(duì)照組、低濃度IL-6組、中濃度IL-6組和高濃度IL-6組TRAP染色陽性區(qū)域與視野面積百分比分別為(12.63±1.28)%、(10.98±0.99)%、(4.69±0.79)%、(2.26±0.83)%，可見，IL-6濃度超過50ng/mL后，中、高處理組和空白對(duì)照組的染色面積差異顯著(P<0.05)。

圖2 TRAP染色下各組破骨細(xì)胞的成熟分化情況A：空白對(duì)照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.2 Assessment of osteoclastic differentiation and maturation with TRAP staining (×200)A: Control group; B: 50ng/mL IL-6 group; C: 100ng/mL IL-6 group; D: 150ng/mL IL-6 group

2.3 骨片掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察，明顯可見骨陷窩形態(tài)及大小均不一，狀如圓形、橢圓形或不規(guī)則形?？瞻讓?duì)照組中骨片上可見散在、分布不均的因破骨細(xì)胞的骨吸收作用引起的骨陷窩，鈣質(zhì)丟失較多，有的形成空洞征象；低濃度IL-6組中骨質(zhì)破壞明顯減輕，仍可見破骨細(xì)胞的偽足和少許空洞形成；中濃度IL-6組中，破骨細(xì)胞偽足形成不明顯，未見明顯空洞形成，但可見微小的凹陷形成；高濃度的IL-6組中骨質(zhì)較完整，未見明顯的骨陷窩形成和骨質(zhì)破壞(如圖3)。掃描電鏡下采集圖像，經(jīng)圖像分析軟件計(jì)算和分析陷窩面積，空白對(duì)照組、IL-6組和聯(lián)合組的骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比分別為：(11.24±1.50)%，(9.41±1.71)%、(3.65±1.04)%、(2.39±0.71)%。由此可見，中、高IL-6處理組和空白對(duì)照組間存在明顯差異(P<0.05)，而低濃度IL-6組和中高濃度IL-6組之間的吸收面積之間也存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 掃描電鏡下各組骨陷窩形成情況A：空白對(duì)照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.3 Evaluation of bone graft resorption using SEM (×800)A: Control group; B: 50 ng/mL IL-6 group; C: 100 ng/mL IL-6 group; D: 150 ng/mL IL-6 group

3 討 論

成骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸收緊密相聯(lián)，而這動(dòng)態(tài)平衡一旦失衡往往導(dǎo)致骨代謝性疾病的發(fā)生，如OP[3]。破骨細(xì)胞是由單核/巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞(又稱為破骨前體細(xì)胞，Osteoclast precursors，OCP)分化而來，其正常成熟分化的條件必須具備c-Fms和RANK兩種受體[4]。然而，由OCP轉(zhuǎn)化為成熟破骨細(xì)胞的過程是一個(gè)復(fù)雜的多細(xì)胞間通過信號(hào)通路交互對(duì)話的過程[5]。一直以來，由基質(zhì)/成骨細(xì)胞釋放的RANKL因子被公認(rèn)為調(diào)節(jié)OC分化、激活、成熟、凋亡等一系列過程最重要的因子之一[6]。本實(shí)驗(yàn)使用的破骨樣細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，是一種經(jīng)典的破骨前體細(xì)胞模型[7-8]。

在正常生理情況下，骨基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞除了分泌RANKL，還能分泌OPG來和RANKL競爭結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制骨質(zhì)的過度吸收[9, 10]。實(shí)驗(yàn)證明，OPG能有效地抑制破骨細(xì)胞的激活、分化，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[11-12]。所以，OPG/RANKL的比例多少在維持骨量平衡和調(diào)控骨重建過程，起著極為重要的作用。通過聯(lián)合運(yùn)用OPG和IL-6，發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的協(xié)同作用，較單獨(dú)運(yùn)用OPG組更能有效地抑制RAW264.7細(xì)胞的成熟分化(P<0.05)[2]。

IL-6是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞激活后分泌，它是一個(gè)分子家族的原型。該家族包括：ILF、OSM、CT-1、IL-11和CNTF等，它們都有一個(gè)極其相似的螺旋結(jié)構(gòu)[13]。IL-6的生物學(xué)活性需要通過其受體介導(dǎo)，IL-6受體是由IL-6的特異受體結(jié)構(gòu)鏈(IL-6R α)和IL-6的信號(hào)傳遞鏈(IL-6R β，亦稱gp130)組成[14]。IL-6只有先與IL-6R α相結(jié)合，并形成IL-6/ IL-6R α復(fù)合物后才能與gp130結(jié)合，進(jìn)而激活Ras/Raf/ERK/MEK、JAK/STAT3等信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮生物效應(yīng)[15]。Laurence等證明：單獨(dú)加入IL-6對(duì)破骨細(xì)胞的分化未見明顯影響，但I(xiàn)L-6可以在分化早期(小于3天)以劑量依賴方式明顯抑制外源性RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化[16]。IL-6能刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生大量的下游信號(hào)分子，如IL-1、PGE2等等，抑制OPG的表達(dá)，促進(jìn)RANKL的表達(dá)，進(jìn)而間接促進(jìn)破骨細(xì)胞形成并加強(qiáng)破骨活動(dòng)[17]，IL-6又能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而直接抑制破骨細(xì)胞的成熟分化和骨吸收作用[18]，這與本研究結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)采用RAW264.7細(xì)胞作為破骨前體細(xì)胞，在體外給與不同濃度的IL-6因子進(jìn)行干預(yù)，當(dāng)濃度超過50 ng/mL時(shí)，連續(xù)作用至第10天時(shí)，可以觀察到明顯的抑制作用?？瞻讓?duì)照組和IL-6處理組進(jìn)行比較，成熟破骨細(xì)胞的生成數(shù)量和骨陷窩形成的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且它們存在一定的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。然而，IL-6如何參與到抑制破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制，還需要在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去研究IL-6和RANKL之間的相互作用關(guān)系。