臨床患者血流真菌感染的實驗診斷及治療研究進展*

馬夢亭，王鳳超

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽蚌埠 233004)

1真菌的定義及病原學真菌(fungus)是一類具有細胞壁、細胞核、線粒體和核糖體等完整細胞器的異養(yǎng)生物，又稱“真核細胞型微生物”。目前自然界中發(fā)現(xiàn)的真菌種類數(shù)不低于160萬種，其中高達600余種真菌對人類具有致病作用，這些致病性真菌主要通過寄生的方式在人類進行有性生殖或無性繁殖[1]。近年來，真菌感染中由念珠菌屬引起的血流感染報道不斷增多。在國外，據(jù)相關文獻報道，念珠菌血癥在醫(yī)院相關血流感染中排名第4位，同時也是重癥監(jiān)護病房真菌感染的主要原因，而由念珠菌血癥造成的死亡比率高達20%～63%[2]。在國內，據(jù)2008～2017年我國深部真菌病原譜及流行特征數(shù)據(jù)顯示，在我國真菌感染中仍存在著9種主要病原性真菌，其中感染念珠菌病例數(shù)占比高達91%，而念珠菌中又以白色念珠菌比例最大，占總念珠菌數(shù)的65%[3]。此外，由熱帶、光滑、克柔等非白色念珠菌造成的血流感染比例近年來也呈現(xiàn)不斷上升趨勢[4]，來自英國的報道表明，在病死率方面，非白色念珠菌血癥已有趕超白色念珠菌血癥的趨勢[5]。

2真菌血流感染的早期診斷方法

2.1 直接鏡檢與染色法 臨床實驗室收到血標本后第一時間應先進行顯微鏡直接鏡檢，直接鏡檢法具有簡便、快速、實用等優(yōu)點，通過鏡檢對菌體形態(tài)的觀察可初步判斷患者是否感染了真菌，如涂片中發(fā)現(xiàn)約45°，分枝且較粗的菌絲，往往提示曲霉菌感染；若見卵圓形芽孢及假菌絲，往往提示念珠菌感染；若見半月形菌體及透明莢膜，往往提示組織胞漿菌感染；若墨汁涂片中見菌體莢膜外厚透亮，則提示隱球菌感染可能[6]。但直接鏡檢法的陽性率低，即使陰性結果也不能排除感染的可能，所以通常真菌涂片的同時需要加用染色法，實驗室常用的染色法有革蘭染色法、吉姆薩染色法和熒光染色法等，其中熒光染色法是一種高效快速、特異度高、敏感性強且較傳統(tǒng)染色法更為精準的一種染色方法[7]。

2.2 真菌培養(yǎng)鑒定法 目前，真菌血培養(yǎng)仍是臨床實驗室檢測真菌血流感染的“金標準”，無論是對真菌亦或是細菌血流感染的診斷，血培養(yǎng)都可謂是診斷“金標準”[8]。其優(yōu)點在于檢測范圍廣，如敏感性較高的分子診斷法其報陽濃度通常在5～19 CFU/ml，而血培養(yǎng)中真菌含量低于1 CFU/ml時，結果即可報陽[9]。真菌血培養(yǎng)鑒定較直接鏡檢法能夠進一步提高病原菌的檢出率，并通過觀察真菌的菌落形態(tài)可以明確病原菌的種類。在臨床實踐中，直接鏡檢法的結果可以解釋血培養(yǎng)的菌種，而血培養(yǎng)的鑒定又是對直接鏡檢法結果的一種驗證，兩者相結合互相取長補短。目前，臨床實驗室最常用的是科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，利用念珠菌代謝產(chǎn)生的酶與培養(yǎng)基中的顯色物質發(fā)生反應產(chǎn)生不同顏色的菌落，觀察菌落顏色即可做出快速判斷，如白色念珠菌菌落呈翠綠色、克柔念珠菌菌落呈粉紅色、熱帶念珠菌菌落呈天藍色、光滑念珠菌菌落呈紫色。但血培養(yǎng)也有其不足之處，首先培養(yǎng)時間長，至少2～3天才可出結果，容易延誤診治；其次，血培養(yǎng)的陽性率并不高，有相關報道血培養(yǎng)的陽性率僅為21%～71%，靈敏度遠低于50%[10]。

2.3 真菌血清學試驗

2.3.1 血清(1，3)-β-D-葡聚糖檢測：β-葡聚糖是除細菌、病毒、人體細胞之外的多種真菌細胞壁的特有成分，有1，3-β-D-葡聚糖[(1，3)-β-D-glucan，BG]和1，6-β-D-葡聚糖兩種類型，其中以BG為主，占β-葡聚糖80%左右。當發(fā)生真菌感染時，機體的吞噬細胞將大量真菌進行吞噬、消化，破壞真菌細胞壁，使BG大量釋放入血，通過檢測血清中BG含量，即可得知是否感染真菌，此試驗又稱“G試驗”。在2008年，歐洲和美國疾病研究組，對深部真菌感染的標準進行了修訂，首次將“G試驗”歸為微生物學檢驗標準[11]。目前由于市場上檢測BG的商品化試劑盒及設定的臨界值各不相同，使得文獻所報道的檢測靈敏度和特異度各有差異。據(jù)相關國外文獻報道，G試驗在臨床診斷中的綜合檢測靈敏度為70%～100%，特異度為80%～100%[12]。此外，G試驗不能用于具有厚壁莢膜的隱球菌屬及細胞壁成分缺少BG的接合菌屬等真菌感染的檢測。

2.3.2 血清半乳甘露聚糖檢測：血清半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)同血清BG相似，為曲霉菌絲細胞壁的特有多聚糖成分，當人體感染曲霉菌時，這種多糖成分會隨著菌絲的生長而釋放入血，菌量越多，GM釋放的越多，人體感染程度越重[13]。GM試驗是曲霉菌感染的早期診斷方法，有相關研究表明患者感染曲霉菌后，臨床癥狀比外周血檢出GM的時間要晚7天左右，而后者又比經(jīng)驗性治療時間早約12天[14]。有研究表明，GM檢測的敏感度和特異度分別可高達67.9%和72.2%[15]。為了提高檢測的靈敏度和特異度，應提倡聯(lián)合BG和GM檢測。

2.3.3 隱球菌莢膜多糖抗原檢測：新型隱球菌莢膜多糖有α-1，3連接的線性甘露糖骨架，成分主要是葡萄糖醛酸-木糖-甘露糖(glucuronoxylomannan，GXM)，而GXM隱球菌莢膜多糖檢測方法主要有以下3種：乳膠凝集試驗、膠體金法以及酶聯(lián)免疫吸附法[16]。①乳膠凝集試驗是將隱球菌抗體球蛋白標記在乳膠顆粒表面，形成致敏乳膠懸液，加入待測血清，產(chǎn)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象，可用于快速診斷。②膠體金法是用膠體金標記單克隆抗體，利用免疫層析技術檢測特異性隱球菌抗原的方法，此法已制成商品試紙條，操作簡單，檢測時間短，約10 min即可出結果。③酶聯(lián)免疫吸附法是將已知特異性抗體包被在聚氯乙烯板孔內，加入患者血清，經(jīng)過溫育、加酶標記抗體、溫育、洗脫等一系列操作后出現(xiàn)肉眼可見的顏色現(xiàn)象。研究表明，三種檢測方法有較好的一致性，且操作簡單，設備要求低，在多數(shù)醫(yī)院即可開展[17]。

2.3.4 曲霉菌抗體(IgM或IgG抗體)檢測：目前國際上有一種新的檢測方法：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測曲霉菌IgM，IgG抗體。其原理為ELISA間接法：將患者血清(含有曲霉菌IgM或IgG抗體)加入包被有曲霉菌抗原的酶標板中，血清中抗體與固相抗原結合，再加入抗人IgM或IgG酶標抗體，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，加入底物產(chǎn)生顯色反應，通過酶標儀測定其吸光度，與標準曲線對比分析抗體含量?；诳贵w的產(chǎn)生需要一定時間而且要求機體免疫功能正?；蚧菊?，所以抗體檢測的臨床價值并沒有抗原檢測的臨床價值大[18]。目前，國內對曲霉菌抗體的研究也不多，但在國外IgG抗體實驗已開始應用于臨床。

2.4 分子生物學診斷法 目前，在真菌感染的診斷及耐藥基因的檢測方面聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction，PCR)是臨床應用最多，研究最熱的技術。此技術通過真菌通用引物和種屬特異性引物分別對待測樣本進行兩次擴增，將目的DNA放大數(shù)百萬倍后再進行測定的技術。該技術較經(jīng)典的鏡檢法、培養(yǎng)法等具有快速、高敏感度、高特異度等優(yōu)點，通常用于真菌的分型、鑒定以及耐藥基因的檢測[19]。依賴核酸序列的擴增技術(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是在PCR的基礎發(fā)展起來的一種新型擴增RNA的技術，它是一個恒溫(42℃)擴增RNA的酶促反應過程，可短時間內將模板RNA擴增到1010左右。NASBA已廣泛應用于細菌、真菌、病毒等多種病原微生物的檢測，相對于傳統(tǒng)的PCR技術更為穩(wěn)定和準確[20]。此外還有基因探針技術、質譜技術、焦磷酸測序技術等多種分子生物學檢測方法可用于真菌的檢測。但分子生物學檢測技術也存在著其不足之處，如成本較高、操作復雜、感染因素較多易產(chǎn)生假陽性、假陰性等，所以其應用價值還有待于進一步考究。

3血流真菌感染的治療按照藥物的作用機制可將經(jīng)典的抗真菌藥物分為以下幾類：①作用于真菌細胞壁：棘白菌素類：此類藥物非競爭性作用于真菌細胞壁中的葡聚糖合成酶，抑制葡聚糖的合成，產(chǎn)生殺滅真菌的作用，這類藥物主要有卡泊芬凈、米卡芬凈等。在2014年的《米卡芬凈臨床應用多學科專家評價》新聞發(fā)布會上，來自7個學科的近40位專家一致認為，米卡芬凈應作為有效治療真菌感染的首選藥物。②作用于真菌的細胞膜：多烯類：此類藥物通過結合真菌細胞膜上的麥角甾醇，形成一種能使胞內容物外漏的跨膜通道，從而造成細胞死亡。目前以兩性霉素B為代表藥多用于臨床，但由于其具有嚴重的腎毒性、神經(jīng)毒性等毒副作用，而較少用于臨床，取而代之的是毒副作用較小的兩性霉素B劑型之一的兩性霉素脂質體B。三唑類：此類藥物可抑制真菌細胞中能催化羊毛甾醇合成麥角甾醇的細胞色素P-450的合成，導致真菌細胞壁上麥角甾醇的缺失，起到殺菌作用。臨床常用的三唑類藥物有氟康唑、咪康唑及伊曲康唑等，其中以氟康唑和伊曲康唑作為首選。③抑制真菌核酸合成：如氟胞嘧啶。此類藥物抗菌譜較窄，僅限于念珠菌、曲霉菌、隱球菌的敏感菌屬，此外，單獨用氟胞嘧啶時，易引起真菌的耐藥性增強。④其它：中藥具有不良反應小、毒副作用小、抗菌譜廣、耐藥率低等特點而成為目前許多研究者關注的對象[21]。

4結語近年來，真菌感染的發(fā)生率不斷上升，越來越嚴重的影響著人類的生命與健康，對高?；颊撸瑧缙陬A防，防止感染的發(fā)生，對已感染的患者，應早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。真菌感染的診斷方法雖然多種多樣，但各有優(yōu)劣，應盡可能的聯(lián)合多種檢測方法對疾病進行早期、快速、準確的診斷，從而為臨床及時有效地治療提供指導。