男性不育患者Y染色體AZF基因微缺失檢測和染色體核型分析*

張麗潔，趙 園，趙喬佳杰，王九菊，李艷春，魏緒倉

(陜西省人民醫(yī)院血液遺傳研究所，西安 710068)

目前越來越多的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中男性方面因素約占 30%～50%，由遺傳因素導致精子生成障礙約占男性不育癥的30%[1]。克氏綜合征(klinefelter syndrome，核型為47，XXY)和Y染色體微缺失是引起男性不育的前兩位遺傳因素?？耸暇C合征在人群中的發(fā)生率約為1/1 000，不育男性中占1/10，是發(fā)生率較高的一種性染色體病。研究證明，Y染色體上長臂1區(qū)1帶(Yq11)存在精子生成相關基因，即無精子癥因子(AZF)，分為AZFa，AZFb和AZFc 3個區(qū)域，這些區(qū)域的缺失會導致生精障礙，引起少精子癥或無精子癥[2]。

本研究對60例不育患者進行Y染色體微缺失檢測和染色體核型分析，進而在細胞和分子遺傳水平探討男性不育的原因。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2019年1月陜西省人民醫(yī)院男科門診就診的60例男性不育患者(嚴重少、弱精癥和無精癥)的全血標本，對照組為30例精液常規(guī)檢測正常的男性志愿者，年齡20～42歲。

1.2 儀器與試劑 德國ZEISS顯微鏡及染色體圖像分析系統(tǒng)。Roche Cobas z480熒光定量PCR儀，外周血淋巴細胞培養(yǎng)基(廣州市達暉生物技術有限公司)，Chromed G吉姆薩染液(上海樂辰生物科技有限公司)，外周血DNA提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)，Y染色體微缺失檢測試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Y染色體微缺失檢測

1.3.1.1 PCR反應體系：實驗操作按照上海透景科技公司的Y染色體微缺失檢測試劑盒進行，采用多重熒光定量PCR方法判斷AZFa區(qū)(sY84，sY86)，AZFb區(qū)(sY127，sY134)和AZFc區(qū)(sY254，sY255)的6個序列標簽位點(STS)的微缺失，同時設置男性性別決定基因(SRY)和編碼鋅指蛋白基因(ZFX/ZFY)為兩個內(nèi)對照基因。SRY，sY84，sY127和sY255為組別A，ZFX/ZFY，sY86，sY134和sY254為組別B。4種熒光標記FAM，VIC，ROX和Cy5分別對應內(nèi)對照(SRY，ZFX/ZFY)，AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)和AZFc(sY254，sY255)。

1.3.1.2 PCR擴增反應條件：第一階段： 50℃ 2 min，95℃ 5 min；第二階段95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38個循環(huán)，在每個循環(huán)的60℃時收集FAM/VIC，ROX和Cy5信號；第三階段72℃延伸5 min。

1.3.1.3 結(jié)果判讀：通過分析擴增曲線判讀結(jié)果，出現(xiàn)典型的S型擴增曲線且Ct值小于32表示基因表達正常，否則表示缺失。

1.3.2 染色體核型分析

1.3.2.1 染色體核型標本制備：采用常規(guī)細胞遺傳學方法進行外周血淋巴細胞培養(yǎng)和G顯帶染色體核型標本制備。

1.3.2.2 核型分析：采用Ikaros核型分析系統(tǒng)軟件計數(shù)20個中期分裂相，采集5個中期分裂相以分析核型。

2結(jié)果

2.1 不育患者Y染色體AZF基因微缺失結(jié)果分析 60例男性不育患者中Y染色體AZF基因缺失的有2例，檢出率為3.33%，且均為AZFc區(qū)的sY254，sY255位點缺失。30例精液常規(guī)檢測正常的志愿者未檢測到AZF基因缺失。

2.2 60例不育患者的染色體核型分析結(jié)果 在60例嚴重少精癥和無精癥的不育患者中檢出5例異常核型(占8.33%)，均為克氏綜合征(47，XXY)，其中3例患者還出現(xiàn)乳房發(fā)育和激素水平的異常，即卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)的水平異常增高和睪酮(TT)水平下降等。該5例染色體異?；颊叩腨染色體AZF基因并無缺失。

3討論很多原因會導致男性不育，遺傳性因素致生精障礙引起的不育占30%，臨床上主要表現(xiàn)為嚴重少、弱精癥和無精癥。目前臨床對男性不育的鑒別大多基于常規(guī)精液分析和血清生殖激素的測定，但這些檢測并不能明確患者是否具有生育能力及對后代的影響，因而開展細胞和分子遺傳檢測對患者的診斷和治療具有重要意義[3-4]。

克氏綜合征和Y染色體微缺失是導致精子發(fā)生障礙的主要遺傳性缺陷?？耸暇C合征患者臨床多表現(xiàn)為身材高大、睪丸小、第二性征發(fā)育不良、不育等，典型病例的血漿睪酮僅為正常人的一半，個別患者睪酮正常。外周血染色體核型分析是診斷克氏綜合征的主要實驗依據(jù)。本文對60例不育男性患者的染色體核型分析結(jié)果與陳琨等[5]對574例男性不育患者的核型研究結(jié)果一致，即不育男性中約有8%為克氏綜合征患者。

Y染色體微缺失發(fā)生的區(qū)域不同，不育患者的臨床表型也有所不同，因此明確Y染色體微缺失有無及缺失位點類型有助于臨床醫(yī)師為不育患者選擇最佳的治療方案。AZFa缺失發(fā)生頻率最低，一般表現(xiàn)為無精癥和唯支持細胞綜合征(SCOS)，此類患者不建議做單精子胞漿內(nèi)注射手術(ICSI)；AZFb，AZFb+c缺失可導致SCOS或生精阻滯，也不建議做ICSI；AZFc缺失最為常見，表現(xiàn)為嚴重少精癥或無精癥，該類患者尚存精子生成能力，可通過ICSI等輔助生育手段獲得后代，建議生女孩，避免AZFc缺失在男性后代的傳遞[6-7]。目前國內(nèi)不同地區(qū)研究者報道的AZF基因微缺失發(fā)生率有所不同。曹金如等[8]對東莞地區(qū)的120例不育患者的Y染色體AZF基因微缺失的檢測中發(fā)現(xiàn)23例AZFc區(qū)缺失，檢出率為19.2%，未發(fā)現(xiàn)其它區(qū)域缺失。樊冰等[9]通過對深圳地區(qū)180例男性不育患者的Y染色體微缺失的分析發(fā)現(xiàn)18例AZFc缺失，2例AZFb+c缺失，缺失檢出率為11.11%。韓瑞玲等[10]發(fā)現(xiàn)346例男性不育患者中有17例Y染色體微缺失，缺失檢出率為4.9%。本研究中的Y染色體微缺失檢出率偏低，這可能與地域差別，或選擇的STS位點有關，且此次分析的標本量偏少，有待后續(xù)研究中增加標本量進一步探討Y染色體微缺失與男性不育的相關性。

綜上所述，遺傳缺陷導致的精子生成障礙是男性不育的重要因素。染色體核型分析和Y染色體AZF基因微缺失檢測有助于篩查男性不育的原因，為醫(yī)師對不育男性的合理診療提供依據(jù)。