高壓均質(zhì)優(yōu)化提取蘆筍多糖及抗氧化能力的研究

付建鑫，張桂香，邵家威，張炳文

（濟南大學食品科學與營養(yǎng)系，山東濟南 250000）

蘆筍學名蘆荀，為百合科的天門冬屬植物，通常稱為龍須菜等。蘆筍富含多種游離的必需氨基酸、微量元素硒和多肽、VC 等多種營養(yǎng)成分[1-3]，同時含有大量的黃酮[4-5]、多糖類[6-7]生物活性成分。蘆筍多糖由多個單糖通過糖苷鍵連接而成，具有降低高血脂、調(diào)節(jié)免疫及預(yù)防癌癥等[8-9]功效。

目前，對于果蔬及植物中多糖的提取方法主要有超聲和微波輔助提取法、有機溶劑萃取法、水提醇沉法及酶解提取法等。傳統(tǒng)加工方法已經(jīng)不能滿足食品工業(yè)化生產(chǎn)中的需求，利用高壓均質(zhì)機處理方法，通過增大壓力破碎細胞壁，增加胞內(nèi)和胞間多糖溶出來達到高效的目的。試驗從蘆筍廢棄老莖（不可食部分） 原料中提取多糖，并通過高壓均質(zhì)機械處理法，以正交設(shè)計試驗優(yōu)化其工藝條件并測定了抗氧化性，為提高蘆筍的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠蘆筍，采自山東濟寧市魚臺蘆筍種植基地。

無水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉、無水葡萄糖、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、鄰菲羅啉、1,1 -二苯基-2 - 三硝基苯肼、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷、Cu2SO4、茚三酮、酒石酸鉀鈉、硫酸鈉、α - 萘酚、醋酸鉛、冰醋酸等均為分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司提供。

WZJ-6J 型振動式藥物超微粉碎機，濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司產(chǎn)品；XO-SM200 型超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品；UV-5500PC 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16M 型冷凍高速臺式離心機，湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、電子分析天平、電熱鼓風干燥箱及其他玻璃儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料制備及處理

將市售綠蘆筍老莖剔除泥沙，切丁于50 ℃下烘干。將綠蘆筍老莖干基用無水乙醇浸提數(shù)次，直至無色；將無水乙醇蒸干，用石油醚浸提24 h，脫去脂肪；浸提后的蘆筍老莖用蒸餾水沖洗，烘干備用。

1.2.2 不同條件機械處理提取多糖

選取經(jīng)過1.2.1 處理后的每1 kg（均以干基計，下同） 恒質(zhì)量綠蘆筍根部原料分別進行振動式超微粉碎處理、超速分散處理、高壓均質(zhì)處理，比較3 種機械處理的多糖提取效果，篩選最佳機械處理方法。

振動式超微粉碎機處理，記為G1：振動式超微粉碎機處理綠蘆筍根部1 kg，振動時間20 min（反振2 min）、次數(shù)1 次，取料提取，測定多糖含量。

高速分散機處理，記為G2：高速分散機處理綠蘆筍根部1 kg，在料液比為1∶20，轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下高速分散2 min 后測定多糖含量。

高壓均質(zhì)機處理，記為G3：高壓均質(zhì)機處理綠蘆筍根部1 kg，在料液比為1∶20，壓力60 MPa，均質(zhì)次數(shù)1 次條件下進行高壓均質(zhì)處理后測定多糖含量。

1.2.3 提取成分定性方法[10]

Feling 反應(yīng)：水提粗多糖液經(jīng)酸水解后，加入新制備的堿性酒石酸銅上層清液；

Molish 反應(yīng)：1 mL 水提粗多糖液加入3 滴α -萘酚振蕩搖勻，加入0.5 mL 濃硫酸；

油斑試驗：將1 mL 乙醚提取粗多糖液置于表面皿，揮干后觀察是否油漬殘留；

丙烯醛試驗：將2 mL 乙醚粗多糖液置于表面皿，揮干后加4 粒Na2SO4加熱；

醋酸鉛沉淀反應(yīng)：2 mL 水提粗多糖液加入飽和醋酸鉛溶液直至無沉淀后，離心取上清液加入堿式醋酸鉛；

酸沉反應(yīng)：1 mL 水提粗多糖溶液加入1%H2SO4；

雙縮脲反應(yīng)：1 mL 水提粗多糖溶液加入3 滴10% NaOH，邊搖勻加入4 滴0.5% H2SO4；

茚三酮反應(yīng)：1 mL 水提粗多糖溶液加入2 滴0.2%茚三酮，搖勻后沸水浴3 min，冷卻。

1.2.4 Sevege 法除蛋白[11]

配制比例為4∶1 的氯仿-正丁醇（Sevege） 溶液，與蘆筍多糖粗提液以1∶3 的比例混合振蕩，靜置10 min，反復(fù)多次至中間層無蛋白。取脫蛋白后的上清液在4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，上層清液即為粗多糖溶液。

1.2.5 多糖沉淀[11]

粗多糖溶液加入過量無水乙醇，于4 ℃下醇沉18 h。在4 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速11 000 r/min 離心20 min，沉淀即為蘆筍粗多糖。

1.2.6 多糖含量的測定

（1） 最大吸收波長的確定。同時移取1 mL H2O，1 mL 6%苯酚，5 mL H2SO4和0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液1 mL，1 mL 6%苯酚，5 mL H2SO4分別作為空白對照和試驗組，放置5 min 后沸水浴15 min，流水沖洗冷卻至常溫后用紫外吸收分光光度計在波長300～800 nm 處進行尋峰。

（2） 標準曲線的繪制。準確稱量干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖0.100 0 g 定容至1 000 mL，即為100 μg/mL的葡萄糖標準液。按表1 配制各所需溶液，搖勻靜置5 min 后沸水浴15 min，流水沖洗冷卻至室溫，在1.2.6（1） 方法中的吸收峰波長處測定吸光度（A），繪制葡萄糖標準曲線。

葡萄糖標準曲線見表1。

表1 葡萄糖標準曲線/mL

（3） 多糖得率的計算。

式中：Y——多糖得率，%；

A0——粗多糖質(zhì)量，mg；

AI——蘆筍原料質(zhì)量，mg。

1.2.7 單因素試驗設(shè)計

在控制單一變量因素條件下，分別考查料液比、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)壓力3 個因素對多糖提取得率的影響。

1.2.8 正交試驗因素與水平

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取料液比、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)壓力3 個因素，選用L9（34）正交試驗，以多糖得率為考查指標，優(yōu)化高壓均質(zhì)法提取蘆筍根部多糖工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.2.9 抗氧化試驗[12]

（1） DPPH 自由基清除試驗。分別配置質(zhì)量濃度為0.25，0.50，1.00，2.25，4.50，9.00，18.00 mg/mL的7 個梯度的蘆筍多糖溶液，分別移取0.4 mL，然后加入0.065 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液7.6 mL于具塞試管中，室溫反應(yīng)30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，試劑溶液為空白。

式中：X——DPPH 自由基清除率，%；

At——多糖溶液吸光度；

A0——試劑空白。

（2） 羥自由基清除試驗。參考段雅慶[12]的方法加以改進，利用Fenton 法[15]反應(yīng)原理，配制1.2.9（1）系列濃度的多糖溶液。按照表3 依次加入搖勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h 后取出，冷卻至室溫用PBS 溶液作參比，于波長510 nm 處測定吸光度。

羥自由基清除反應(yīng)步驟見表3。

表3 羥自由基清除反應(yīng)步驟/mL

式中：Y——羥自由基清除率，%；

A2——多糖溶液吸光度；

A0——試劑空白；

A1——過氧化氫試劑空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種機械提取法多糖得率結(jié)果

不同方法提取多糖得率見圖1。

由圖1 可知，在提取原料為1 kg 干質(zhì)量時，高速分散處理提取多糖得率最低，僅達到1.90%；高壓均質(zhì)法提取多糖得率最高，在料液比為1∶20，壓力60 MPa，均質(zhì)次數(shù)1 次條件下，提取率達3.76%。因此，通過高壓均質(zhì)方法提取多糖效果最好。

圖1 不同方法提取多糖得率

2.2 蘆筍提取成分定性檢驗結(jié)果

蘆筍提取成分定性檢驗見表4。

表4 蘆筍提取成分定性檢驗

由表4 可知，綠蘆筍根部提取液中，含有糖、多糖或糖苷，少量氨基酸、蛋白質(zhì)及多肽，不含有黃酮及油脂等成分。原料干粉經(jīng)過乙醇和乙醚浸提后，除去了醇溶性色素、多酚、黃酮及油脂等成分，可測定多糖抗氧化性。

2.3 最大吸收波長

試驗結(jié)果顯示，于波長490 nm 處樣品溶液的吸光度達到最大，A=0.781。最終，選擇測定蘆筍多糖含量時的最佳吸收波長為496 nm。

2.4 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線

由圖2 可知，以吸光度（A） 為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度（C，μg/mL） 為橫坐標作回歸分析，得回歸方程：A=0.048 1C+0.006 2，R2=0.999 1。

2.5 高壓均質(zhì)處理法的單因素結(jié)果

2.5.1 料液比對多糖得率的影響

料液比對多糖得率影響見圖3。

圖3 料液比對多糖得率影響

由圖3 分析可知，隨著料液比增加，多糖提取得率隨之升高，料液比為1∶30 時多糖提取率達到最高，此時多糖得率為3.84 %；當料液比繼續(xù)升高至1∶35 時，多糖得率反而降低。可能的原因是，料液比的增加不利于溶劑的充分提取，使提取效率下降。因此，試驗選擇的最佳料液比為1∶30。

2.5.2 均質(zhì)次數(shù)對多糖得率的影響

均質(zhì)次數(shù)對多糖得率影響見圖4。

圖4 均質(zhì)次數(shù)對多糖得率影響

由圖4 分析可知，均質(zhì)次數(shù)對多糖得率的影響較小，分別均質(zhì)1，2，3 次的多糖得率分別為3.89%，4.14%，4.21%。即使均質(zhì)3 次較2 次的多糖得率提高了0.02%，但考慮到實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟成本和提取效率，故確定高壓均質(zhì)次數(shù)為2 次。

2.5.3 均質(zhì)壓力對多糖得率的影響

均質(zhì)壓力對多糖得率影響見圖5。

圖5 均質(zhì)壓力對多糖得率影響

由圖5 分析可知，隨著均質(zhì)壓力的增大，多糖得率也提高。當均質(zhì)壓力達到80 MPa 時，多糖得率達到3.84%，此時多糖得率增加幅度最大。其原因是隨著壓力的增加，部分細胞破壁，處于胞內(nèi)和胞質(zhì)中的多糖溶出細胞，進而增加了多糖的得率[13]。當均質(zhì)壓力繼續(xù)增加到100 MPa 時，多糖得率4.07%，此時多糖提取率達到最大，但相比80 MPa 的多糖得率僅增加0.23%。該均質(zhì)機最大均質(zhì)壓力120 MPa，實際生產(chǎn)中考慮到耗能及升壓的時間成本，防止壓力過高爆缸，因此選擇80 MPa 為最佳均質(zhì)壓力。

2.6 正交試驗結(jié)果及極差分析

正交試驗結(jié)果見表5。

表5 正交試驗結(jié)果

由表5 可知，影響高壓均質(zhì)處理蘆筍多糖得率的3 個因素的主次順序為均質(zhì)壓力（A） ＞料液比（B） ＞均質(zhì)次數(shù)（C），最優(yōu)組合為A3B3C3，即均質(zhì)壓力100 MPa，料液比1∶35，均質(zhì)3 次為高壓均質(zhì)處理蘆筍的最佳試驗條件。

平行驗證試驗結(jié)果見表6。

表6 平行驗證試驗結(jié)果

在均質(zhì)壓力100 MPa，料液比1∶35，均質(zhì)3 次工藝條件下進行3 次平行試驗，蘆筍粗多糖的平均得率為4.16%。

2.7 抗氧化能力結(jié)果分析

蘆筍多糖對DPPH 自由基和·OH 的清除能力見圖6。

由圖6 可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除率也隨之增大，清除能力較羥自由基清除率更高。當多糖質(zhì)量濃度分別達到2.25 mg/mL和1.0 mg/mL 時，DPPH 自由基和羥自由基的清除增長率明顯減??；當多糖質(zhì)量濃度達到18 mg/mL 時，二者清除能力達到最高，分別為74.2%和68.4%。由此可見，蘆筍多糖對DPPH 自由基、羥自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖6 蘆筍多糖對DPPH 自由基和·OH 的清除能力

3 結(jié)論

比較了振蕩式超微粉碎、高速分散及高壓均質(zhì)3 種不同處理方式的蘆筍多糖得率。采用高壓均質(zhì)處理的方式，在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗方法優(yōu)化提取蘆筍多糖并測定了抗氧化性。結(jié)果表明，高壓均質(zhì)處理相比于振動式超微粉碎和高速分散處理具有較好的多糖提取效果。結(jié)合試驗條件和實際操作，其正交優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為均質(zhì)壓力100 MPa，料液比1∶35，均質(zhì)3 次，多糖得率平均為4.16%，具有較好的抗氧化能力。