中國(guó)CBAVD 患者CFTR 基因內(nèi)含子10-11(TAAA)n 短串聯(lián)重復(fù)序列檢測(cè)及意義

白 松 吳 斌

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 泌尿外科（遼寧沈陽(yáng) 110004）

前 言

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)子基因 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR，OMIM602421，基因突變可以導(dǎo)致先天性雙側(cè)輸精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens，CBAVD，OMIM 277180）的發(fā)生，在白種人中78%的CBAVD 患者至少有一種CFTR 基因變異類型， 其中46%同時(shí)存在兩種變異類型。 白種人中約98%～99%的CBAVD 患者同時(shí)合并囊性纖維化（cystic fibrosis,CF,OMIM219700），而我國(guó)絕大部分為單獨(dú)發(fā)病，不合并囊性纖維化。

CFTR 基因突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜氯離子通道功能障礙，無(wú)法調(diào)節(jié)氯離子和水分子的流通，由此導(dǎo)致生殖道產(chǎn)生的黏稠狀分泌物無(wú)法排除， 在胚胎期間即會(huì)導(dǎo)致輸精管梗阻和變性，由此可能導(dǎo)致CBAVD 的發(fā)生[1]。

關(guān)于我國(guó)CBAVD 患者CFTR 基因變異的研究非常有限，已有的研究表明，在黃種人群中外顯子突變率較低，且絕大多數(shù)突變頻率小于0.1%，分布也與白種人完全不同[2]。 這說(shuō)明CFTR 基因外顯子突變具有明顯的種族特異性，而且其非編碼區(qū)可能存在導(dǎo)致CBAVD 疾病發(fā)生的變異，而這些變異類型不會(huì)導(dǎo)致CF 的發(fā)生。

短串聯(lián)序列廣泛的分布于基因組非編碼區(qū)， 其重復(fù)片段的長(zhǎng)短與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。 同樣在CFTR基因非編碼區(qū)內(nèi)， 存在大量的二聚體和四聚體短串聯(lián)序列， 其通過(guò)與啟動(dòng)子相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而影響基因的表達(dá)。 (TAAA)n 微衛(wèi)星片段是位于內(nèi)含子10-11 中的由4 個(gè)堿基組成的重復(fù)序列， 雖然不像內(nèi)含子9-10中的Tn 那樣會(huì)影響第10 號(hào)外顯子mRNA 的剪接，造成第10 外顯子被漏轉(zhuǎn)錄，但是Estelle 等[3]的研究表明：IVS10-11(TAAA)n 短串聯(lián)序列可以與FOXI1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)CFTR 基因的表達(dá)，當(dāng)其重復(fù)數(shù)量減少時(shí)與FOXI1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合力增加， 從而影響CFTR 基因的轉(zhuǎn)錄。 尤其當(dāng)其與啟動(dòng)子c.-165G＞A 的輕微突變或與IVS9-10 （TG）mTn 相組合時(shí)， 可以導(dǎo)致CBAVD的發(fā)生， 是非常重要的順式作用原件，IVS10-11(TAAA)n 短串聯(lián)序列及其與啟動(dòng)子c.-165G＞A 變異的情況在中國(guó)人群中未見(jiàn)相關(guān)研究。 本研究旨在探索中國(guó)CBAVD 患者CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n 及啟動(dòng)子c.-165G＞A 的分布情況及其意義。

材料與方法

一、標(biāo)本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在本院就診的66 名CBAVD 患者為實(shí)驗(yàn)組及60 名因女方因素于我院行輔助生殖的健康男性為對(duì)照組； 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組患者均簽署知情同意書(shū)。

CBAVD 患者納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：（1）兩名?？漆t(yī)師同時(shí)查體，觸診雙側(cè)精索未觸及輸精管，睪丸大小正常（Prader 睪丸模型＞12mL）；（2）無(wú)囊性纖維化其他癥狀，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；（3）精液分析檢查至少3 次，無(wú)精子，射精后尿液沉淀后也未見(jiàn)精子（除外逆行射精）， 精液量＜1.5mL，pH＜6.4， 精漿果糖＜13umol/mL 和ɑ-糖苷酶＜20μmol/mL；（4）超聲提示附睪頭飽滿，呈網(wǎng)格狀，可以伴有附睪尾以及精囊萎縮或缺如；（5）性激素水平正常；（6）染色體正常；（7）經(jīng)皮睪丸穿刺取出精子行ICSI 輔助生殖；（8）無(wú)明確家族遺傳疾病。

生育力正常男性對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1） 女方因素行ART；（2）精液分析正常；（3）性激素正常；（4）染色體正常。

二、外周血樣本采集和DNA 提取

抽取外周血4～6mL，EDTA 抗凝后，-20℃保存。 采用AxyPrep 全血基因組DNA 提取試劑盒 （Axygen 公司，美國(guó)）提取DNA，DNA 試劑盒成分包括：BufferAP1（細(xì)胞裂解液）30mL，BufferAP2 （蛋白沉淀液）6 mL，Buffer W1A concentrate （洗滌液）24mL，Buffer W2 concentrate（去鹽液）24mL，Buffer TE（洗脫液）11mL。 DNA提取操作步驟： 加500μLBuffer AP1 細(xì)胞裂解液到1.5mL 離心管中； 加200μLEDTA 抗凝全血到Buffer AP1 中，渦旋振蕩10s；加100μLBuffer AP2 蛋白沉淀液渦旋振蕩10s，然后12 000×g離心10min；將制備管放入2mL 離心管中，將上述離心后的上清加入制備管中，然后12 000×g離心10min；棄濾液，加入700μL Buffer W1A concentrate 洗滌液，室溫放置2min，然后12 000×g離心30s；棄濾液，加入800uL Buffer W2 concentrate 去鹽液，室溫放置2min，然后12 000×g離心1min；棄濾液，將制備管至于新的1.5mL 離心管中，在中央懸滴加100μl Buffer TE 洗脫液，室溫放置1min，然后12,000×g離心1min，離心管內(nèi)即為DNA；使用UV 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)本濃度及純度，OD260nm/OD280nm 位于1.8～2.0 之間，否則重新提取，最后-80℃保存。

三、CFTR 基因內(nèi)含子10-11 (TAAA)n 熒光FAM標(biāo)記引物，PCR 擴(kuò)增及PCR 產(chǎn)物毛細(xì)管電泳法檢測(cè)STR 分子標(biāo)記

根據(jù)Ensembl 網(wǎng)站的CFTR 基因序列(http://asia.ensembl.org/index.html) 使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由ncbi-blast 驗(yàn)證特異性， 委托北京博奧生物有限公司合成引物， 引物信息為正鏈(5'to3')GGAGGCTGAGGCAGGAGAA， 反鏈(5'to3')AGAAAAGCTGAAAGTCAAAAGG，5’ 端-FAM 標(biāo)記，PCR 產(chǎn)物大小約360bp左右。

PCR 反應(yīng)體系： 共計(jì)25μl， 包括水19.8μl，Taq Buffer 2.5μl，dNTP 10mM 0.5μl， 引物f 0.5μl， 引物R 0.5μl，Taq 酶5U/μl 0.2μl，模板1μl。 PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3min，變性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)數(shù)30 循環(huán)，修復(fù)延伸72℃6min。 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨機(jī)挑4 個(gè)樣本PCR 產(chǎn)物檢測(cè)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物 （2%瓊脂糖凝膠電泳， 參數(shù)設(shè)置150V，100mA，20min）。

熒光標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：取96 孔反應(yīng)板，標(biāo)明板名、實(shí)驗(yàn)日期，制作電子版檢測(cè)表，并自動(dòng)生成上機(jī)表；使用連續(xù)加樣器，吸取990μl HIDI 和10μl LIZ500的混合物，加入到96 孔反應(yīng)板中，每孔10μl；將96 孔板置于平板離心機(jī)中，離心500g 即停；使用12 排10μl排槍，對(duì)照檢測(cè)表，在96 孔板對(duì)應(yīng)的孔中加入50pg 的樣品；將96 孔板置于平板離心機(jī)中，離心500×g即停；使用封板膜密封96 孔板，振蕩，將96 孔板置于平板離心機(jī)中， 離心500×g即停， 置于PCR 儀； 變性程序?yàn)?8℃5min，程序結(jié)束后立即將96 孔板置于冰水混合物上急速冷卻，再置于平板離心機(jī)中，離心2000×g即停；使用ABI 3730xl 測(cè)序儀檢測(cè)STR 樣本。 選取標(biāo)準(zhǔn)樣本，根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)樣本定標(biāo)，使用Genemapper 軟件分析STR 數(shù)據(jù)，橫坐標(biāo)為片段大小，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值，根據(jù)片段大小來(lái)判斷結(jié)果。

四、CFTR 基因ATG 轉(zhuǎn)錄起始前1.4kb 啟動(dòng)子測(cè)序

根據(jù)Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)CFTR 基因啟動(dòng)子序列（http://asia.ensembl.org/index.html）， 使用primer premiere 5.0設(shè)計(jì)引物，ncbi-blast 驗(yàn)證特異性， 由TaKaRa Biotechnology(大連，中國(guó))合成，PCR 引物序列5'-TCACAAGACCCTTGCCTTAG-3' (forward) and 5'-GCCTTTTCC AGAGGCGACCT-3' (reverse). 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1402 bp，使用1%瓊脂糖凝膠（TaKaRa 公司，日本）電泳確認(rèn)該引物合成DNA 片段的特異性。

PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本），總反應(yīng)體系20μl，包括DNA 樣品0.5μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，2.5mmol dNTP Mix 1.6μl，Primer 10.8μL，Primer 20.8μL，5u Ex Taq 0.2μL，ddH2O 14.1μL。

PCR 反應(yīng)條件：初始變性95℃，5 分鐘；變性95℃，30s； 退火58℃,30s； 延伸72℃，40s； 終末延伸72℃，10min； 共計(jì)30 個(gè)PCR 循環(huán)。 純化擴(kuò)增產(chǎn)物后使用ABI 7500 Sequence Detection System 測(cè)序儀測(cè)序。

五、生物學(xué)信息來(lái)源和分析軟件

基因組數(shù)據(jù)庫(kù)：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen ome/guide/human；http://www.ensembl.org； 引物設(shè)計(jì)軟件：Primer 5.0；基因比對(duì)：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat；基因序列分析軟件：Chromas1.6。

六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher's exact test 和非條件logistic 回歸，P＜0.05 認(rèn)為有意義。

結(jié) 果

一、CFTR IVS10-11(TAAA)n，熒光FAM 標(biāo)記引物PCR 毛細(xì)管電泳法檢測(cè)結(jié)果

在CBAVD 患者中IVS10-11(TAAA)n基因型分布有6 種，分別為(TAAA)9/(TAAA)9、(TAAA)9/(TAAA)10、

(TAAA)9/ (TAAA)11、 (TAAA)9/ (TAAA)12、 (TAAA)10/(TAAA)10和(TAAA)10/(TAAA)11，分別所占的百分比為：21.21%、50.00%、9.09%、3.03%、12.12%和4.55%；以(TAAA)9/(TAAA)10基因型為主（50.00%）；正常人群則僅有(TAAA)9/(TAAA)9和(TAAA)9/(TAAA)10兩種基因型，分別所占的百分比為：78.33%和21.67%，以(TAAA)9/(TAAA)9為主(78.33%)，這與CBAVD 組明顯不同。 兩組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fisher's exact test=45.903，P＜0.01），見(jiàn)圖1，表1。

CBAVD 組等位基因可見(jiàn)4 種類型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和 (TAAA)12， 所 占 比 例 分 別 為52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。 正常人群的對(duì)照組僅可見(jiàn)2 種等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分別為89.17%和10.83%， 兩組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X2=60.589，P＜0.01），見(jiàn)圖1、表2。

表1 CFTR IVS10-11(TAAA)n 基因型分布情況

表2 CFTR IVS10-11(TAAA)n 等位基因型分布情況

二、IVS10-11(TAAA)n 基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度

非條件Logistics 回歸分析結(jié)果表明：(TAAA)9/(TAAA)10基因型患 CBAVD 的風(fēng)險(xiǎn)是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.228 倍，見(jiàn)表3。

表3 CFTR IVS-9(TAAA)n 基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度

三、啟動(dòng)子c.-165G＞A 變異結(jié)果

66 名CBAVD 患者均未發(fā)現(xiàn)CFTR 基因啟動(dòng)子c.-165G＞A 變異，見(jiàn)圖2。

圖2 CFTR 基因c.-165G＞A 變異情況a:CFTR 基因啟動(dòng)子1.4kb PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；b:CFTR 基因c.-165G＞A 正常純合型

討 論

1989 年Riordan 等[5]首先克隆了CFTR 基因（OMIM 602421） 的cDNA 片段并鑒定了其產(chǎn)物CFTR 蛋白（OMIM 602421），該基因位于7q31.2，包含約250kb[6]。CFTR 基因有高度多態(tài)性，目前NCBI 公布的CFTR 基因有2009 種突變形式，絕大部分發(fā)生率低于0.01%，極少數(shù)變異類型超過(guò)1%[7]。 目前研究顯示78%的CBAVD 患者至少有一種CFTR 基因變異類型， 其中48%同時(shí)存在兩種變異類型， 大部分為溫和的點(diǎn)突變（IV/V 級(jí)），很少有基因缺失或重排出現(xiàn)，約＜1%[8]。 其突變頻率及熱點(diǎn)，因地域和種族不同而有差別很大，白種人CFTR 基因突變率明顯高于黃種人。

囊性纖維化（CF）在白種人中發(fā)病率約為1/2500，大約1/25 的人群為突變基因的攜帶者， 而在黃種人中CF 非常罕見(jiàn)， 發(fā)病率小于0.1/10 萬(wàn)，CF 的男性患者中95%～99%存在CBAVD[9]，而在我國(guó)，絕大部分僅存在CBAVD， 不合并囊性纖維化。 白種人和黃種人的CBAVD 發(fā)病率相似，約為1/1000，是常染色體隱性遺傳疾病。 目前認(rèn)為CBAVD 為囊性纖維化的一個(gè)輕度的臨床表現(xiàn)類型，定義為囊性纖維化相關(guān)疾病，可以單獨(dú)發(fā)病，也可以同時(shí)合并囊性纖維化[10]。 一般認(rèn)為一個(gè)嚴(yán)重雜合突變聯(lián)合一個(gè)輕微雜合突變（88%）或者兩個(gè)輕微的雜合突變（12%）會(huì)導(dǎo)致CBAVD 的發(fā)生，而一個(gè)嚴(yán)重的純合突變（88%）或兩個(gè)嚴(yán)重的雜合突變（12%）會(huì)導(dǎo)致CF 的發(fā)生[11]。

白種人CBAVD 患者最常見(jiàn)的等位突變基因?yàn)閜.F508del、IVS9-10 5T 和p.R117H， 出現(xiàn)的頻率分別為21%～33%、25%～44%和3%[12,13]最常見(jiàn)的基因型為p.F508del/IVS9-10 5T 和p.F508del/p.R117H，頻率分別為28%和6%[4]。我國(guó)關(guān)于CBAVD 患者CFTR 基因突變的研究有限，外顯子突變率低約12.7%～37.0%，而且絕大多數(shù)突變頻率小于1%，分布也與白種人完全不同[2]。 這表明導(dǎo)致CBAVD 的CFTR 基因突變位點(diǎn)可能位于非編碼區(qū)。

短串聯(lián)序列廣泛的分布于基因組非編碼區(qū)，其重復(fù)片段的長(zhǎng)短與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如II 型肌萎縮[18]及男性女乳[19]，既往的研究也證實(shí)位于啟動(dòng)子及內(nèi)含子[20,21]中的微衛(wèi)星片段能夠影響基因轉(zhuǎn)錄。 同樣在CFTR 基因非編碼區(qū)內(nèi)， 存在大量的二聚體和四聚體短串聯(lián)序列， 其通過(guò)與啟動(dòng)子相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而影響基因的表達(dá)。 (TAAA)n微衛(wèi)星片段是位于CFTR 基因內(nèi)含子10～11 中的由4 個(gè)堿基組成的重復(fù)序列，雖然不像內(nèi)含子9～10 中的Tn 那樣會(huì)影響第10 號(hào)外顯子mRNA 的剪接，造成第10 外顯子被漏轉(zhuǎn)錄，但是Estelle 等[3]的研究表明：FOXI1 轉(zhuǎn)錄因子可以與IVS10-11 (TAAA)n短串聯(lián)序列結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)CFTR 基因的表達(dá)，當(dāng)其重復(fù)數(shù)量減少時(shí)與FOXI1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合力增加， 從而影響CFTR 基因的轉(zhuǎn)錄。 原因可能為改變DNA 結(jié)構(gòu)來(lái)影響其轉(zhuǎn)錄效率， 比如通過(guò)使DNA 結(jié)構(gòu)彎曲或呈環(huán)狀后，會(huì)易化順式作用原件和反式作用因子之間的作用，尤其與c.-165G＞A 同時(shí)存在，致病風(fēng)險(xiǎn)更加增大。 FOXI1轉(zhuǎn)錄因子是由FOX 基因（winged helix/forkhead box）編碼的一組核蛋白，通過(guò)與DNA 內(nèi)高度保守的forkhead順式作用元件結(jié)合， 廣泛參與組織和器官的分化和形成， 其具有明顯的組織特異性[22]。 最近的研究表明，F(xiàn)OXI1 對(duì)生精功能有重要作用，Blomqvist[23]將小鼠的FOXI1 基因敲除后，發(fā)現(xiàn)小鼠無(wú)法繁殖，另有研究也發(fā)現(xiàn)其對(duì)附睪成熟也具有重要作用[24]。

國(guó)外研究顯示正常白種人(TAAA)n 以9 為主，CF患者以11 為主， 并且一般與p.F508del 突變連鎖，CBAVD 患者也以9 為主，偶見(jiàn)6 和8[25,3]，目前沒(méi)有我國(guó)CBAVD 患者和正常人群的相關(guān)資料， 本研究結(jié)果表明我國(guó)人群與白種人不同，CBAVD 組等位基因可見(jiàn)4 種類型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12，所占比例分別為52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。正常人群僅可見(jiàn)2 種等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分別為89.17%和10.83%，CBAVD 患者等位基因(TAAA)9頻率明顯低于正常人群， 兩組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

我國(guó)CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10為主約占50.00%，(TAAA)9/(TAAA)9僅占21.21%；正常人群基因型則以(TAAA)9/(TAAA)9為主，約占78.33%，兩組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；另外3 種等位基因型(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12均只出現(xiàn)在CBAVD 患者中，同時(shí)在我國(guó)CBAVD 患者和正常人群中均未見(jiàn)到(TAAA)6或(TAAA)8的等位基因類型。根據(jù)logistic 回歸分析我們發(fā)現(xiàn)(TAAA)9/(TAAA)10基因型患CBAVD 的風(fēng)險(xiǎn)是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.22倍，如果出現(xiàn)(TAAA)10、(TAAA)11或(TAAA)12則患病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高。這表明我國(guó)人群的CFTR 基因內(nèi)含子10～11(TAAA)n分布完全不同于白種人， 而是有明顯的種族特異性， 隨著重復(fù)次數(shù)的增多，CBAVD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。

另外Estelle 等[3]認(rèn)為(TAAA)n與啟動(dòng)子c.-165G＞A 突變有協(xié)同作用， 會(huì)引起CFTR 基因轉(zhuǎn)錄水平下降， 導(dǎo)致疾病發(fā)生。 而根據(jù)啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果顯示我國(guó)CBAVD 患者中均未發(fā)現(xiàn)此種突變，說(shuō)明我國(guó)CBAVD患者(TAAA)n變異與此啟動(dòng)子突變無(wú)協(xié)同作用。

CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n的多態(tài)性與白種人不同， 我國(guó)CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10為主，正常人群基因型則以(TAAA)9/(TAAA)9為主。 同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)IVS10-11(TAAA)n與啟動(dòng)子c.-165G＞A 突變有協(xié)同作用。