RAS阻滯劑及LCZ696對動脈粥樣硬化小鼠 ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的影響研究

謝冬琳 戴婷 黃麗 麥一峰 蔣峻 謝燕青 何文明

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種與血脂異常及血管壁成分改變有關的動脈疾病，主要累及大中型動脈，其共同特點是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小[1]。臨床試驗證實，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病中起著重要作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素 -（1-7）[angiotensin-（1-7），Ang-（1-7）]在減少平滑肌細胞增殖和遷移、改善內皮功能、調節(jié)脂質代謝等方面發(fā)揮了重要作用，可以抑制動脈粥樣硬化病變和增加斑塊的穩(wěn)定性[2]；而血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）可以通過水解血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ） 生成 Ang-（1-7）。所以，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸有可能成為動脈粥樣硬化新的治療靶點。

血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）類藥物為目前廣泛應用于臨床的RAS阻滯劑；而LCZ696[3，4]是首個血管緊張素受體-腦啡肽酶雙重抑制劑，可在抑制有害的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的同時增強心臟保護性神經(jīng)內分泌系統(tǒng)。利鈉肽（natriuretic peptide，NP）是維持體內水鈉平衡的一個重要神經(jīng)內分泌多肽家族，具有排鈉利尿、舒張血管、抗增殖的作用，還可以抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)[5]。本研究擬通過動物實驗比較不同RAS阻滯劑及LCZ696對動脈粥樣硬化小鼠ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的影響，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性ApoE-/-小鼠28只，C57BL/6小鼠7只，6周齡，購于北京維通利華公司。

1.1.2 藥物與試劑 高脂飼料（18.4%脂肪）購于北京博泰宏達公司，生產(chǎn)批號2017072304，規(guī)格2kg；依那普利購自江蘇制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號17091111，規(guī)格5mg；纈沙坦購自北京諾華公司，生產(chǎn)批號H20040217，規(guī)格80mg；LCZ696購自瑞士諾華公司，生產(chǎn)批號TN026，規(guī)格50mg；ELISA Kit購自上海橋杜生物公司，生產(chǎn)批號20180106，規(guī)格96次；TRIzol試劑購自美國ambion公司，生產(chǎn)批號140501，規(guī)格100ml；HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物公司，生產(chǎn)批號50231，規(guī)格 100rxns；Fs essential DNA green Marker購自美國羅氏公司，生產(chǎn)批號31498300，規(guī)格10ml；引物購自深圳華大基因，β-actin的Primer ID：180507_003A06，ACE2 的 Primer ID：171204_012G07；ACE2兔單克隆抗體購自美國abcam公司，生產(chǎn)批號 GR145000-19，規(guī)格 100μl；Ang-（1-7）兔多克隆抗體購自美國ImmunoClone公司，生產(chǎn)批號P2018041609，規(guī)格100μl；免疫組化試劑盒購自北京索拉寶公司，生產(chǎn)批號20180620，規(guī)格1kit。

1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀：深圳庫貝爾公司；酶標儀：美國Thermo公司；倒置顯微鏡：Nikon儀器（上海）有限公司；超微量紫外分光光度計：香港基因有限公司；PCR儀：德國eppendorf公司；熒光定量PCR儀：美國Roche LightCycler 480Ⅱ。

1.1.4 動脈粥樣硬化模型構建、分組及給藥 將ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)14周建模后按隨機數(shù)字表分為4組，每組7只，分別予以0.9%氯化鈉溶液（ApoE-/-對照組）、依那普利（8mg/kg，依那普利組）、纈沙坦 （30mg/kg，纈沙坦組）、LCZ696（60mg/kg，LCZ696組）灌胃處理，C57BL/6組小鼠予以等量0.9%氯化鈉溶液。干預6周后處死以上5組小鼠，取血樣及病理標本。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平測定 小鼠眼眶靜脈取血后，常溫靜置 30min，離心（3000r/min，10min），取上清，用全自動生化分析儀檢測血脂水平。

1.2.2 血清CRP、IL-6水平測定 取小鼠血清，按CRP （Mouse CRP ELISA Kit）、IL-6[Mouse IL-6 ELISA Kit]酶聯(lián)免疫試劑盒說明書步驟進行CRP、IL-6水平測定。

1.2.3 血清ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平測定 取小鼠血清，按ACE2（Mouse ACE2 ELISA Kit）、Ang- （1-7）[Mouse Ang- （1-7）ELISA Kit]、AngⅡ[Mouse AngⅡ ELISA Kit]酶聯(lián)免疫試劑盒說明書步驟進行 ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平測定。

1.2.4 判斷建模是否成功 取整根主動脈，沿內圈剖開，油紅O工作液染10min，70%酒精分化，蒸餾水沖洗，鋪平拍照。

1.2.5 斑塊脂質含量測定 制作冰凍切片：取小鼠主動脈根部，多聚甲醛固定1h、20%蔗糖溶液過夜、30%蔗糖溶液過夜、O.C.T.包埋后切片備用。冰凍切片油紅O染色：先用PBS洗滌5min，60%異丙醇浸潤，油紅O染10min，60%異丙醇終止反應，蘇木素復染3min，自來水返藍，干燥，甘油封片，拍照，用Image J分析圖片陽性面積。

1.2.6 主動脈ACE2mRNA表達的檢測 （1）用TRIzol試劑從主動脈組織中提取總RNA，用超微量紫外分光光度計測RNA濃度并確定逆轉錄時需要加入的RNA量；（2）按HiFiScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟加樣，在PCR儀中合成cDNA；（3）取 cDNAⅡ1μl，在熒光定量 PCR 儀中進行PCR反應，并與內參照（β-actin）同時擴增。引物序列分別為：ACE2上游引物：5'-TGGTCTTCTGCCATCCGATT-3'，下游引物：5'-CCATCCACCTCCAC TTCTCTAA-3'；β-actin 上游引物：5'-TATTGGCAA CGAGCGGTTC-3'，下游引物：5'-ATGCCACAGGATT CCATACCC-3'。建立20μl的擴增反應體系，依次加入：RNase-Free Water 7μl，F(xiàn)s essential DNA green Marker（10μl，cDNA1μl，上游引物 1μl，下游引物1μl。反應條件：94℃預變性 5min；PCR 循環(huán) 95℃10s，56℃20s，72℃30s；最后 72℃延伸 1min。擴增 45個循環(huán)。結果采用2-△△CT法進行分析。

1.2.7 主動脈斑塊中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達的檢測 取小鼠主動脈弓制作冰凍切片后按免疫組化試劑盒檢測ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達，拍照，用Image J分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血脂水平測定 與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組LDL-C、TC水平顯著升高且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ApoE-/-對照組、依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組LDL-C、TC水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖1。

圖 1 各組血脂水平比較（A：LDL-C，B：TC；與 C57BL/6 組相比，*P＜0.01）

2.2 各組血清CRP、IL-6水平 與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組血清CRP、IL-6水平顯著升高（均P＜0.01）；與ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組血清CRP、IL-6水平顯著降低（均P＜0.01），見圖 2。

2.3 各組血清ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平 與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組血清 ACE2、Ang-（1-7）水平顯著降低（P＜0.01），AngⅡ水平顯著升高（P＜0.01）；與 ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組血清ACE2及Ang-（1-7）水平顯著升高（P＜0.01），AngⅡ水平顯著降低且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖 3。

圖2 各組血清CRP、IL-6水平比較（與C57BL/6組相比，#P＜0.01；與ApoE-/-對照組相比，*P＜0.01）

圖 3 各組血清 ACE2、Ang-（1-7）、AngⅡ水平比較（與 C57BL/6 組相比，#P＜0.01；與 ApoE-/-對照組相比，*P＜0.01）

2.4 各組主動脈大體油紅O染色 肉眼可見，與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組斑塊明顯增多，說明AS建模成功；與ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組斑塊均有減少，其中以LCZ696組減少最為顯著，見插頁圖4。

2.5 各組主動脈根部冰凍切片油紅O染色 肉眼可見，與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組斑塊明顯增多；與ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組斑塊均有減少，其中以LCZ696組減少最為明顯（插頁圖5）。與C57BL/6組相比，ApoE-/-對照組斑塊陽性面積顯著增加（P＜0.01）；與ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組斑塊陽性面積顯著減少（P＜0.01）；與依那普利組、纈沙坦組相比，LCZ696組斑塊減少更明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 6。

2.6 各組主動脈ACE2 mRNA的表達 與ApoE-/-對照組相比，依那普利組ACE2 mRNA的表達水平明顯升高（P＜0.01），LCZ696組ACE2 mRNA的表達水平升高且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖7。

圖6 各組主動脈根部斑塊脂質含量（與C57BL/6組相比，#P＜0.01；與ApoE-/-對照組相比，*P＜0.01；與依那普利組、纈沙坦組相比，△P＜0.05）

2.7 各組主動脈斑塊ACE2和Ang-（1-7）蛋白的表達 與ApoE-/-對照組相比，依那普利組、纈沙坦組和LCZ696組主動脈斑塊中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與依那普利組、纈沙坦組相比，LCZ696組主動脈斑塊中ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達增加更明顯且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或 0.05）（見圖 8、插頁圖 9）。

3 討論

圖7 各組主動脈ACE2 mRNA的表達（與ApoE-/-對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01）

動脈粥樣硬化促進了心腦血管疾病的發(fā)生，是一種炎癥、血栓、多種細胞類型相互作用的復雜病理過程。RAS具有重要生理功能，同時RAS的異常激活及其介導的炎癥、氧化應激和內皮功能紊亂參與了AS的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。近年來發(fā)現(xiàn)的RAS家族新成員Ang-（1-7），讓人們對RAS在AS進程中的作用有了更加完整的認識。Ang-（1-7）的生物學效應主要通過G蛋白偶聯(lián)受體Mas介導，其可抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，改善內皮細胞功能，調節(jié)脂質代謝，從而達到延緩AS進程，增加斑塊穩(wěn)定性的作用[7-8]。因此，作為傳統(tǒng) RAS的重要補充，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸可延緩 AS 的進展，具有重要的心血管保護效應[2，9]。

圖8 各組主動脈斑塊ACE2（A）、Ang-（1-7）（B）蛋白的表達（與ApoE-/-對照組相比，*P＜0.01；與依那普利組相比，#P＜0.01；與纈沙坦組相比，△P＜0.05，▲P＜0.01）

本研究中依那普利、纈沙坦、LCZ696對血脂（LDL-C和TC）的影響與ApoE-/-對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，提示其并非通過降低血脂來發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸具有抗增殖、減少氧化應激及炎癥作用。眾多研究表明[10-11]，通過阻斷RAS的不同環(huán)節(jié)，可提高ACE2、Ang-（1-7）濃度及表達，進而起到抗動脈粥樣硬化作用。國內學者Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)氯沙坦可增加血管平滑肌細胞中ACE2的濃度、抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，進而提示有抗動脈粥樣硬化作用。本課題組近期研究也證實，卡托普利和氯沙坦的干預下自發(fā)性高血壓大鼠平滑肌細胞中的Ang-（1-7）濃度增加[13]。本研究發(fā)現(xiàn)依那普利組和纈沙坦組血清中的ACE2和Ang-（1-7）濃度升高、AngⅡ濃度降低、炎癥因子CRP、IL-6水平顯著降低、主動脈斑塊中的ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達增加、主動脈脂質斑塊含量亦減少；且依那普利還可以增加主動脈ACE2 mRNA的表達。提示循環(huán)及局部的ACE2和Ang-（1-7）在抑制AS形成發(fā)展中起重要作用。而且依那普利和纈沙坦可通過作用不同的RAS環(huán)節(jié)，提高循環(huán)ACE2和Ang-（1-7）濃度、降低AngⅡ濃度、增加主動脈ACE2和Ang-（1-7）蛋白及分子的表達、降低炎癥因子水平，進而起到抗動脈粥樣硬化作用。

LCZ696是一種新型血管緊張素受體-腦啡肽酶雙重抑制劑，因其能改善心力衰竭患者的預后，臨床上用于治療射血分數(shù)降低的心力衰竭[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與ApoE-/-對照組相比，LCZ696組主動脈脂質斑塊明顯減少，血清ACE2和Ang-（1-7）濃度升高，AngⅡ濃度降低，炎癥因子CRP、IL-6水平顯著降低，主動脈ACE2 mRNA的表達增加，主動脈斑塊中的ACE2和Ang-（1-7）蛋白表達增加。提示LCZ696 可以通過 ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸起到抗動脈粥樣硬化作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)與纈沙坦組相比，LCZ696組主動脈脂質斑塊面積減少更明顯。推測與LCZ696中的腦啡肽酶抑制劑有關。據(jù)報道[15]，長期使用腦啡肽酶抑制劑可減少動脈粥樣硬化的形成，保護內皮依賴性血管舒張，以及增強腦鈉肽的內皮舒張作用，并抑制促動脈粥樣硬化的內皮素。此外，腦啡肽酶抑制劑可以降低心房利鈉肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）在內的利鈉肽的降解。ANP具有抗動脈粥樣硬化的特性，有研究發(fā)現(xiàn)[15]在體外培養(yǎng)的人動脈內皮細胞中，ANP可以防止血栓介導的內皮細胞通透性增加，這可能減少脂質蛋白等大分子穿過內皮屏障，從而減少斑塊形成。最后應該指出的是，我們的目標不是單獨評價ARB或腦啡肽酶抑制劑的個體貢獻，而是評估兩者聯(lián)合使用是否有更好的抗動脈粥樣硬化作用。本研究結果與先前的藥動學研究[16]一致，證實兩者發(fā)揮藥效方面有協(xié)同作用，在抗動脈粥樣硬化上比單用ARB效果更顯著。

綜上所述，依那普利、纈沙坦和LCZ696均可通過ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，且LCZ696抗動脈粥樣硬化作用更明顯。