脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用

向進(jìn)瓊

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350108

干細(xì)胞被定義為具有自我更新和多向分化能力的克隆細(xì)胞，負(fù)責(zé)損傷后正常組織的更新、愈合和再生[1]。長(zhǎng)期以來，干細(xì)胞一直吸引著科學(xué)家的注意，科學(xué)家們對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行了大量的研究，基于干細(xì)胞的組織工程也是一種很有前途的方法[2-3]。根據(jù)干細(xì)胞所在發(fā)育階段的不同，干細(xì)胞被分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）。雖然與ESC 相比，來源于成體組織的ASC 分化潛能更小，但這些細(xì)胞倫理問題較少，因此人們對(duì)源自成體組織的干細(xì)胞的研究越來越感興趣。這些成體干細(xì)胞現(xiàn)已從各種組織中分離出來，如骨髓、大腦、脂肪、皮膚、神經(jīng)和牙齒組織等[2]。與從其他組織中獲取干細(xì)胞相比，牙源性干細(xì)胞的獲取及儲(chǔ)存既簡(jiǎn)單又方便，已成為研究熱點(diǎn)。來自恒牙髓組織、乳牙髓組織和多生牙髓組織的干細(xì)胞，其特異性表面標(biāo)記物和分化潛能各不相同[4]。據(jù)報(bào)道，脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from hu?man exfoliated deciduous teeth，SHED）在多能性和增殖能力方面似乎是效果最好的細(xì)胞[5]。

2003年，Miura[6]等首次分離出SHED，發(fā)現(xiàn)與牙髓干細(xì)胞（DPSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）相比，SHED具有更高的增殖率和群體倍增值。此外，SHED是從脫落乳牙的殘留牙髓中分離出來的，因此無須倫理考慮就可以輕易獲得。乳牙向恒牙的過渡是一個(gè)非常獨(dú)特和動(dòng)態(tài)的過程，乳牙的牙髓在出生前就已存在，一直維持到恒牙萌出前，在這個(gè)時(shí)期，這些干細(xì)胞尚未受到遺傳或環(huán)境因素累積效應(yīng)的嚴(yán)重影響[7]。SHED也可以在體外和體內(nèi)分化為成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及皮膚和神經(jīng)細(xì)胞等[6,8-9]。由此可見，SHED具有多種優(yōu)勢(shì)，有廣闊的應(yīng)用前景。

1 脫落乳牙牙髓干細(xì)胞

1.1 脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的特征

SHED表現(xiàn)出多種間充質(zhì)干細(xì)胞特性，例如具有典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)特征、克隆性、細(xì)胞表面抗原表達(dá)、細(xì)胞增殖能力和多向分化潛能[6]。表型分析顯示SHED表達(dá)多種間充質(zhì)標(biāo)記物，如CD105、CD90、CD146、CD166、CD117、CD105、CD73、CD71、CD44、CD29、CD10和SSEA-4，但不表達(dá)CD34、CD197、CD184、CD133、CD106、CD63、CD49e、CD45、CD31、CD7和HLA-DR[6,10-15]。這些結(jié)果證明SHED非造血多能干細(xì)胞，因?yàn)樗鼘?duì)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34表達(dá)呈陰性。此外，與DPSC 相比，SHED高表達(dá)CD117和CD105，說明SHED更不成熟，且應(yīng)該具有更好的分化潛能[10]。與DPSC和BMMSC 相比，SHED生長(zhǎng)穩(wěn)定，具有更高的增殖活性，SHED表達(dá)更多與細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)途徑的基因，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和腫瘤生長(zhǎng)因子β[16-18]。

除了具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，SHED還顯示出與BMMSC 類似的強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能。與BMMSC 相比，SHED在上調(diào)Treg和Th17細(xì)胞比例方面表現(xiàn)出更顯著的效果[19]。在體外，SHED顯著抑制Th17 活性，還能有效逆轉(zhuǎn)MRL/lpr 小鼠中的系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)病癥[19]。Dai[20]等研究表明，SHED減少了鼻腔炎癥，并糾正了變應(yīng)性鼻炎小鼠模型中的CD4+T細(xì)胞免疫失衡，通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的擴(kuò)增來抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖并增加Th1/Th2的比例。這些結(jié)果表明SHED具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。

1.2 脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的多能性

1.2.1 成骨分化 成骨誘導(dǎo)分化后，SHED會(huì)表達(dá)多種骨標(biāo)記物，如核心結(jié)合因子、堿性磷酸酶、細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白和成骨細(xì)胞標(biāo)志物Osterix 等[6-7,19-21]。SHED是一種潛在的成骨細(xì)胞來源，其成骨分化潛能大于DPSC，但與BMMSC 相比較低[22]。近年來，已發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)能夠影響SHED的成骨分化能力。Liu[23]等以硼酸鎂和硼酸鋅作為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)SHED，21 d后發(fā)現(xiàn)其成骨細(xì)胞分化明顯，分化細(xì)胞鈣礦物大量沉積，并表達(dá)多種骨相關(guān)基因，如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、Runx2、骨鈣素、骨橋素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管生成素1。證實(shí)硼酸鎂和硼酸鋅是成骨細(xì)胞分化的重要誘導(dǎo)因子，這些二價(jià)金屬離子和B離子可以從支架中釋放到培養(yǎng)基中，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。當(dāng)在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入白細(xì)胞介素6后，SHED堿性磷酸酶的表達(dá)顯著上調(diào)，礦物沉積也明顯增多，與磷酸鹽代謝相關(guān)的基因也發(fā)生了顯著變化。說明白細(xì)胞介素6 能提高SHED的礦化能力，誘導(dǎo)骨向分化[24]。在含CoCl2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SHED，其成骨相關(guān)基因的表達(dá)則會(huì)被抑制，堿性磷酸酶活性和鈣沉積均呈劑量性降低，說明CoCl2抑制了SHED的成骨分化[25]。由于其成骨分化潛能，SHED成為骨再生工程研究中重要的細(xì)胞來源。

1.2.2 成脂分化 已有研究表明，SHED具有向脂肪細(xì)胞分化的能力。用脂肪誘導(dǎo)混合物培養(yǎng)SHED可以使其向脂肪細(xì)胞分化，并使PPAR-γ和脂蛋白脂肪酶（2種脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)記物）的表達(dá)上調(diào)，油紅O 染色結(jié)果也證實(shí)了SHED的成脂分化[6,26-28]。與DPSC 相比，SHED的成脂分化能力更高。然而，與BMMSC 相比，SHED脂肪形成分化明顯降低，表現(xiàn)為脂質(zhì)特異性油紅O 陽性細(xì)胞數(shù)量減少以及PPARγ2和脂蛋白脂肪酶的表達(dá)減少[19]。相反的是，Pivoriuūnas[29]等在一項(xiàng)評(píng)估分化的研究中發(fā)現(xiàn)SHED具有強(qiáng)烈的成骨分化能力，但沒有脂肪形成潛力。

1.2.3 成軟骨分化 利用含有ITS、抗壞血酸、丙酮酸鈉、脯氨酸、地塞米松、胎牛血清、TGF-β、BMP-6、青霉素和鏈霉素成分的誘導(dǎo)混合物，可以使SHED在體外發(fā)育成軟骨細(xì)胞[8]。Chen[30]等的研究也證明，SHED在包含地塞米松、胰島素、維生素C、TGF-β3和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的成軟骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周可以分化為軟骨樣細(xì)胞。此外，將SHED與β-TCP 支架混合植入裸鼠背部皮下，SHED表現(xiàn)出克隆形成能力和軟骨向分化。Koyama[31]等發(fā)現(xiàn)，在用BMP-2 處理的SHED和DPSC的微團(tuán)培養(yǎng)物中均出現(xiàn)軟骨細(xì)胞結(jié)節(jié)，但DPSC 中軟骨形成標(biāo)志物（Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原和Sox9）的水平顯著低于SHED。

1.2.4 成牙分化 Miura[6]等的研究證明SHED在體內(nèi)和體外都能夠分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。但Gronthos[32]等報(bào)道，它還不能再生如DPSC 中所見的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。另外，SHED表達(dá)BMP 受體，在牙片/支架中培養(yǎng)的SHED中阻斷BMP-2 信號(hào)通路會(huì)抑制成牙細(xì)胞分化標(biāo)志物表達(dá)，表明牙本質(zhì)衍生的BMP-2 是誘導(dǎo)SHED成牙本質(zhì)細(xì)胞分化所必需的[33]。Sakai[34]等將SHED植入牙片/支架材料皮下植入小鼠背部32 d后，牙片髓腔向心形成牙髓樣組織，包括牙本質(zhì)小管和前牙本質(zhì)。這些組織中牙本質(zhì)涎磷蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 等成牙本質(zhì)分化標(biāo)志物表達(dá)呈陽性，表明SHED具有分化成功能齊全的成牙本質(zhì)細(xì)胞的能力，這些成牙本質(zhì)細(xì)胞能夠在體內(nèi)沉積類似于牙本質(zhì)的礦化結(jié)構(gòu)。

1.2.5 成神經(jīng)分化 大量研究表明，SHED在非神經(jīng)誘導(dǎo)條件下會(huì)表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物，包括巢蛋白、β-3 微管蛋白、谷氨酸脫羧酶、神經(jīng)元特異性核蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)絲蛋白和2，3-環(huán)核苷酸-3-磷酸二酯酶，這可能是由于牙髓起源于神經(jīng)嵴[6,35]。Nourbakhsh[36]等將神經(jīng)誘導(dǎo)劑bFGF 加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)SHED，5 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸失去間充質(zhì)外觀，表現(xiàn)出更多的神經(jīng)樣細(xì)胞外觀，包括神經(jīng)元樣生長(zhǎng)，進(jìn)一步添加SHH/FGF8 可使細(xì)胞具有細(xì)長(zhǎng)和精細(xì)的軸突或樹突樣結(jié)構(gòu)。Su[37]等研究證實(shí)，SHED在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，不僅表達(dá)早期神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白，同時(shí)也表達(dá)晚期標(biāo)記物神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白及2，3-環(huán)核苷酸-3-磷酸二酯酶。此外，SHED在三維殼聚糖導(dǎo)管和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)條件下，神經(jīng)向分化能力增強(qiáng)，特別是膠質(zhì)纖維酸性蛋白和2，3-環(huán)核苷酸-3-磷酸二酯酶的基因表達(dá)分別增加了28倍和53倍[37]。這些結(jié)果表明，在離體培養(yǎng)條件下，SHED可分化為功能性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理SHED，2周后其形態(tài)發(fā)生變化，并表達(dá)β-3 微管蛋白、GATA 結(jié)合蛋白3、原肌球蛋白受體激酶B，說明SHED也可以分化為螺旋神經(jīng)節(jié)樣神經(jīng)元細(xì)胞[15]。

1.2.6 成肝細(xì)胞分化在添加了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抑瘤素M的無血清培養(yǎng)基中，SHED的形態(tài)從成纖維細(xì)胞樣向卵圓肝細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變。在分化和成熟28 d后，細(xì)胞表達(dá)與肝細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物白蛋白、甲胎蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、肝細(xì)胞核因子4α和氨基甲酰磷酸合成酶1[38]。該結(jié)果表明SHED具有向肝細(xì)胞分化的潛力。Ishkitiev[39]檢測(cè)了硫化氫對(duì)肝細(xì)胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)在暴露于硫化氫的測(cè)試組中，肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物比在對(duì)照組中表達(dá)更多，尿素和糖原的產(chǎn)生也有所增加。隨后，Su[40]等發(fā)現(xiàn)在含有甘草和當(dāng)歸提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SHED在甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)上呈陽性，證實(shí)甘草、當(dāng)歸等中草藥可誘導(dǎo)SHED向肝細(xì)胞分化。

2 脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用

2.1 骨再生

許多體內(nèi)研究報(bào)道了SHED在人工創(chuàng)造的顱蓋缺損中的骨再生的適用性。de Mandonca[41]等發(fā)現(xiàn)SHED和膠原膜在顱骨骨缺損中誘導(dǎo)新骨形成，并在大鼠中形成板層骨。SHED與HA/TCP 支架移植能夠誘導(dǎo)免疫缺陷小鼠顱骨骨缺損關(guān)鍵部位的骨再生，再生組織含有大量人類骨骼結(jié)構(gòu)和骨髓樣成分[42]。在Nakajima[43]的研究中，PLGA膜與SHED的移植也誘導(dǎo)了顱骨缺損中新骨的形成，而且SHED移植與hDPSC和hBMSC 移植產(chǎn)生的新骨量大致相同。然而，在Behnia[44]等進(jìn)行的研究中，SHED與膠原支架移植的部位和僅僅用膠原支架移植的對(duì)照組相比，缺損下頜骨中骨再生沒有明顯差別，在缺損的舌側(cè)和底部再生的骨組織都是致密的。在骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中，靜脈注射SHED能夠增加骨密度并恢復(fù)骨小梁結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組相比，注射SHED的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)更高水平的成骨細(xì)胞特異性基因Runx2、堿性磷酸酶和骨鈣蛋白[45]。Lee[46]等把SHED細(xì)胞培養(yǎng)膜片植入腭突，體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)表達(dá)骨特異性成骨標(biāo)記物Osterix、骨鈣素和骨橋蛋白，證明SHED細(xì)胞培養(yǎng)膜片具有礦化潛能。這些研究結(jié)果均表明SHED是一種理想的骨組織工程的來源。

2.2 牙髓修復(fù)

將SHED與可注射支架移植到人前磨牙根管中，體外培養(yǎng)后可表達(dá)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)記基因[47]。另外，將此根管移植到免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的全長(zhǎng)根管中產(chǎn)生功能性牙髓。與對(duì)照人牙髓相比，使用可注射支架與SHED產(chǎn)生的牙髓組織呈現(xiàn)相似的細(xì)胞性和血管形成[47]。這些研究證實(shí)SHED具有在體內(nèi)生成牙髓樣組織的能力，表明其在牙髓組織工程中的潛在應(yīng)用。

2.3 神經(jīng)再生

SHED具有顯著的神經(jīng)再生活性，可促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。Sakai[11]等將DPSC和SHED移植到脊髓損傷大鼠模型中，移植的DPSC 或SHED明顯提高了后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，并且移植的SHED抑制了神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而在損傷的中心周圍區(qū)域中保留了神經(jīng)絲和髓鞘。SHED在體內(nèi)進(jìn)行神經(jīng)源性分化的潛力，為利用這些細(xì)胞作為替代模型治療不同的神經(jīng)相關(guān)疾病提供了可能。

2.4 疾病治療

通過脾臟將SHED移植到CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SHED明顯恢復(fù)了肝功能障礙，并使受體肝臟產(chǎn)生抗纖維化和抗炎作用，SHED直接轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞而不發(fā)生細(xì)胞融合[48]。Yokoyama[49]的研究證明，將來源于SHED的肝樣細(xì)胞移植到CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠中，肝硬化大鼠肝臟再生，該病癥明顯恢復(fù)。因此，使用SHED來治療肝疾病也可能是一個(gè)有效的選擇。Rao[50]等研究表明，SHED對(duì)Goto-Kakizaki 大鼠中二型糖尿病有改善作用。在尾靜脈注射SHED后8周，SHED顯著逆轉(zhuǎn)了糖尿病誘導(dǎo)的G-6-Pase、Pck1和PK的增加和糖尿病誘導(dǎo)的GSK3β、GLUT2和PFKL的減少，胰島和肝臟的損傷也得到改善[50]。將來源于SHED的細(xì)胞外囊泡經(jīng)鼻腔給藥帕金森疾病模型小鼠后，發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞外囊泡能有效逆轉(zhuǎn)步態(tài)障礙，使SN和紋狀體TH表達(dá)正?；?，延緩疾病的進(jìn)展，減輕帕金森患者的殘疾[51]。

3 結(jié)語

SHED代表了不成熟的干細(xì)胞群，是一種易獲得、低侵襲性的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以很容易地在體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，并分化為多種細(xì)胞。SHED長(zhǎng)期冷凍保存后仍可保持未分化和穩(wěn)定性，也不影響其生物學(xué)和免疫學(xué)特性。SHED的這些特性使其成為組織工程和干細(xì)胞治療的最有價(jià)值的來源?；诟杉?xì)胞的牙齒再生顯示出潛在的臨床應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，牙齒干細(xì)胞的研究將為組織工程和再生醫(yī)學(xué)開辟更廣闊的應(yīng)用前景。