核纖層蛋白A翻譯后修飾研究進(jìn)展

廖自強(qiáng)，牛海濤，王清水，林堯

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州350100

真核生物細(xì)胞核包含核孔復(fù)合物、核基質(zhì)、核纖層等成分。核纖層是核纖層蛋白（lamins）在內(nèi)核膜的核漿面形成的致密蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]，主要功能是維持細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)核孔復(fù)合物之間的間隔[2]，對(duì)核組裝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 修復(fù)等細(xì)胞功能具有重要作用[3-6]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種重要修飾方式，是受到嚴(yán)格調(diào)控的一個(gè)過程。真核生物中包含至少20種不同的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化、磷酸化、法尼基化、甲基化等。核纖層蛋白A 作為一種重要的細(xì)胞核骨架蛋白，翻譯后修飾對(duì)其功能具有較大影響。因此，本文主要概述核纖層蛋白A的翻譯后修飾相關(guān)研究進(jìn)展。

1 核纖層蛋白A的結(jié)構(gòu)與功能

核纖層蛋白是存在于細(xì)胞核內(nèi)的V 型中間絲（intermediate filament，IF），具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端球狀區(qū)域、位于中部的α螺旋桿狀域、C端球型尾部區(qū)域。α螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域由L1、L12、L2 結(jié)構(gòu)域分為4 段區(qū)域，即1A、1B、2A和2B。2B 結(jié)構(gòu)域后面有一個(gè)核定位信號(hào)域（nucle?ar localization signal，NLS），是核纖層蛋白進(jìn)入細(xì)胞核所必需的定位信號(hào)[7]。C端與核定位信號(hào)之間有一個(gè)免疫球蛋白樣模序（Ig-fold）。哺乳動(dòng)物的核纖層蛋白分為A 型（LMNA）和B 型（LMNB），A 型核纖層蛋白主要包括核纖層蛋白A、AΔ10、C、C2，B 型核纖層蛋白主要包括核纖層蛋白B1、B2，其中A、C、B1和B2 是核纖層蛋白的主要組成部分[8-9]。LMNA基因包含12個(gè)外顯子，核纖層蛋白A在第10個(gè)外顯子處進(jìn)行剪切形成核纖層蛋白C。核纖層蛋白A和C的N端566個(gè)氨基酸殘基相同，核纖層蛋白C 缺少部分10 號(hào)外顯子和11、12 號(hào)外顯子編碼的氨基酸序列[10]。核纖層蛋白A 前體的C端尾部是由18個(gè)氨基酸殘基組成的包含CAAX 模序的特殊結(jié)構(gòu)。

2 核纖層蛋白A的翻譯后修飾

翻譯后修飾對(duì)核纖層蛋白A的功能具有重要作用，能影響核纖層蛋白A的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、與DNA的結(jié)合及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等。目前研究表明，核纖層蛋白A有多種翻譯后修飾，如法尼基化、SUMO 化、泛素化、磷酸化等。

2.1 核纖層蛋白A的法尼基化修飾

蛋白質(zhì)的異戊二烯化修飾廣泛存在于真核細(xì)胞中，主要分為牻牛兒酰牻牛兒基化修飾和法尼基化修飾[11]。核層蛋白A 前體需要進(jìn)行法尼基化修飾才能形成成熟的核纖層蛋白A。核纖層蛋白A 前體的C端（-CSIM）是CAAX 模序，可以引發(fā)法尼基化修飾。首先，法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶（FTase）識(shí)別核纖層蛋白A 前體尾端的-CSIM 序列，將聚異戊二烯基團(tuán)連接到半胱氨酸的硫醇基上；然后，C端的3個(gè)氨基酸殘基SIM 被金屬蛋白酶ZMPSTE24（zinc metalloproteinase Ste24）和RCE1（Ras and α-factor converting enzyme）單個(gè)或者2個(gè)酶共同作用剪除，這2個(gè)酶在剪切過程中哪個(gè)起主要作用尚未確定[12]；下一步，結(jié)合在半胱氨酸上的聚異戊二烯基團(tuán)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被異戊烯半胱氨酸羧基端甲基轉(zhuǎn)移酶（isoprenylcysteine carbox?yl methyltransferase，ICMT）進(jìn)行甲基化修飾[13]；最后，核纖層蛋白A 前體在金屬蛋白酶ZMPSTE24的作用下切除包括法尼基化和羧甲基化半胱氨酸在內(nèi)的15個(gè)C端氨基酸殘基（647～661 aa），最終形成成熟的核纖層蛋白A（1～646 aa）[14]。

核纖層蛋白A 前體C端的-CSIM 發(fā)生法尼基化修飾后使C端疏水性更強(qiáng)，可以更好地定位和保留在核內(nèi)膜；然而核纖層蛋白C 不包含CAAX結(jié)構(gòu)，但是也可以定位在核膜。因此，法尼基化修飾化可能并不是核纖層蛋白A 定位到核膜不可或缺的過程[15]。核纖層蛋白A 一旦定位到核膜，就被酶進(jìn)一步加工除去C端包括法尼基團(tuán)在內(nèi)的18個(gè)氨基酸殘基，然而B 型核纖層蛋白一直保持法尼基化的狀態(tài)。法尼基化修飾過程較快，一般無法檢測(cè)到該過程。

2.2 核纖層蛋白A的SUMO 化修飾

SUMO 是廣泛存在于真核生物中的類泛素多肽，目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)4種SUMO基因，即SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4[16-17]。SUMO化作為一種類泛素化修飾，其反應(yīng)過程是一種與泛素反應(yīng)過程相似的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，修飾過程一般由3種酶催化，即E1 激活酶、惟一的E2 結(jié)合酶UBC9（ubiquitin-conjugating 9）和E3 連接酶。SUMO 化修飾可以調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性、蛋白的亞細(xì)胞定位，干擾蛋白間的結(jié)合，改變蛋白的構(gòu)象而暴露或隱藏與其他蛋白結(jié)合的位點(diǎn)等[18-19]。SUMO 化是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，SUMO的特異性蛋白酶（sentrin/SUMO-specific protease，SENP）可將SUMO與修飾的蛋白從結(jié)合狀態(tài)解離，稱為去SUMO 化。

Zhong 等[20]用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)到核纖層蛋白A與UBC9 存在相互作用關(guān)系，暗示核纖層蛋白A 可能存在SUMO 化修飾。Zhang 等[21]在HeLa細(xì)胞中，用核纖層蛋白A 抗體免疫共沉淀內(nèi)源SUMO1、SUMO2/3，檢測(cè)到SUMO2/3 可以與核纖層蛋白A 發(fā)生共沉淀，所以核纖層蛋白A 可能與SUMO2/3 結(jié)合發(fā)生SUMO 化修飾，通過對(duì)核纖層蛋白A 序列的分析，在高度保守的桿狀區(qū)域K201位置預(yù)測(cè)到SUMO的識(shí)別與結(jié)合模序MKXE（rep?resents hydrophobic amino acids），對(duì)K201 進(jìn)行突變（K201R），檢測(cè)結(jié)果顯示SUMO2/3與突變后的核纖層蛋白A 共沉淀明顯變少，進(jìn)一步對(duì)結(jié)合模序MKXE的E 進(jìn)行突變（E203G，E203K），發(fā)現(xiàn)E位點(diǎn)突變后與K201 突變具有相似效果，共沉淀也明顯減少，所以MKXE 模序?qū)UMO 化修飾具有重要作用。此外，K201R、E203G、E203K 位點(diǎn)單獨(dú)突變后進(jìn)行熒光定位檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量核纖層蛋白A 聚集成點(diǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)或核周，并且檢測(cè)到突變后促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，說明SUMO 修飾位點(diǎn)突變后影響核纖層蛋白A的定位和凋亡。

Simon 等[22]在Cos-7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白A能與SUMO1和SUMO2 結(jié)合，體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明SUMO1 對(duì)核纖層蛋白A 尾部區(qū)域的親和性比SUMO2 更強(qiáng)。通過多個(gè)SUMO 化修飾預(yù)測(cè)軟件比對(duì)選出潛在的核纖層蛋白A 尾部區(qū)域SUMO修飾的位點(diǎn)，分別對(duì)篩選到的位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后做共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示只有K420 位點(diǎn)突變成R后與SUMO1的結(jié)合明顯變少，同時(shí)對(duì)非SUMO 識(shí)別序列位點(diǎn)K486 進(jìn)行點(diǎn)突變后通過共沉淀實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)SUMO1 結(jié)合減少。因此有觀點(diǎn)提出，K486能與SUMO 結(jié)合的原因可能是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)處由多個(gè)酸性殘基形成一個(gè)UBC9 識(shí)別的位點(diǎn)。

Sharma 等[23]在MEFs細(xì)胞中用免疫共沉淀方法檢測(cè)到去SUMO 化酶SENP1 可以與核纖層蛋白A 結(jié)合，在SENP1表達(dá)缺失的MEFs細(xì)胞中核纖層蛋白A表達(dá)量上升。而且已有報(bào)道核纖層蛋白A蛋白可以被SUMO 化修飾，因此SENP1表達(dá)的缺失可能是由于去SUMO 化作用的減少導(dǎo)致核纖層蛋白A表達(dá)上升。

2.3 核纖層蛋白A的泛素化修飾

泛素是廣泛存在于真核細(xì)胞中的由76個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守蛋白。將泛素傳遞到靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)合需要泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的參與，這3種酶進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)將泛素進(jìn)行傳遞，最終泛素才能與靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)合和標(biāo)記[24]。泛素標(biāo)記的靶標(biāo)蛋白可通過26S 蛋白酶體進(jìn)行降解[25]，介導(dǎo)真核生物體內(nèi)80%～85%的蛋白質(zhì)降解；或者不經(jīng)過26S 蛋白酶體作用，改變靶蛋白的構(gòu)象和功能，調(diào)節(jié)其定位和分布[26]。蛋白質(zhì)的泛素化是動(dòng)態(tài)、可逆的結(jié)合修飾過程。靶蛋白上的泛素可被去泛素化酶（deubiquitin，DUB）作用脫離，稱為去泛素化。

Sharma 等[23]在MEFs細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132，檢測(cè)內(nèi)源核纖層蛋白A 蛋白的表達(dá)。當(dāng)加MG132后，與未加的MEFs細(xì)胞相比核纖層蛋白A的表達(dá)明顯上升。并且在SENP1突變、SUMO1突變、SUMO1和SENP1同時(shí)突變的MEFs細(xì)胞中加入MG132后，核纖層蛋白A的表達(dá)均有上升。因此，核纖層蛋白A 可能受到泛素的修飾進(jìn)而發(fā)生泛素-蛋白酶體途徑的降解。采用高通量質(zhì)譜分析方法，Wagner 等[27]利用HEK293T細(xì)胞、Kim 等[28]利用結(jié)腸腺癌細(xì)胞CT116，均檢測(cè)出核纖層蛋白A 潛在的多個(gè)泛素化位點(diǎn)。

2.4 核纖層蛋白A的磷酸化修飾

蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化主要是由蛋白質(zhì)激酶催化作用將ATP 或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移至特定底物蛋白氨基酸殘基的過程[29]，是一種在生物體內(nèi)廣泛存在且非常重要的翻譯后修飾方式，細(xì)胞內(nèi)超過30%的蛋白質(zhì)可發(fā)生磷酸化修飾。

核纖層蛋白A 含有多個(gè)保守的激酶識(shí)別位點(diǎn)，可被多種激酶磷酸化。目前發(fā)現(xiàn)的核纖層蛋白A的磷酸化位點(diǎn)已經(jīng)超過30個(gè)，有些磷酸化位點(diǎn)在細(xì)胞有絲分裂期間發(fā)生磷酸化，伴隨著核纖層蛋白多聚體的解聚，最終導(dǎo)致核膜的裂解。在細(xì)胞分裂間期，磷酸化會(huì)被磷酸化酶進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，這使得解聚的核纖層蛋白重新聚合形成致密內(nèi)核膜結(jié)構(gòu)[30]。核纖層蛋白分解和聚集依賴磷酸化和去磷酸化，這是細(xì)胞周期過程細(xì)胞核的保守功能。

周期蛋白依賴性激酶CDK1 可以分別磷酸化核纖層蛋白A 位于N端區(qū)域的S22和尾部區(qū)域的S392，有研究表明這2個(gè)位點(diǎn)其中一個(gè)發(fā)生磷酸化就足以使核纖層蛋白A 發(fā)生解聚[31-32]。HeLa細(xì)胞中用磷酸化特異性抗體檢測(cè)結(jié)果表明，有絲分裂過程中核纖層蛋白T19、S22、S393和S636 位點(diǎn)的磷酸化增加2～6倍[33]。也有報(bào)道其他激酶也可以磷酸化核纖層蛋白A 位點(diǎn)導(dǎo)致解聚[34-35]。核纖層蛋白A的S404 同時(shí)是PKC和AKT 這2個(gè)蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)，PKC 激酶磷酸化核纖層蛋白A 可以促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核[36]。將核纖層蛋白A的S403和S404 位點(diǎn)進(jìn)行突變，即突變后位點(diǎn)不能發(fā)生磷酸化（S403A和S404A），突變后發(fā)現(xiàn)可以抑制其進(jìn)入細(xì)胞核，所以磷酸化可以影響核纖層蛋白A在細(xì)胞內(nèi)的定位[34,37]。在生理?xiàng)l件下AKT 可以使核纖層蛋白A的S301和S404 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，而且核纖層蛋白A 前體S404 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后可促進(jìn)其前體蛋白的降解。將外源核纖層蛋白A 前體的S403和S404 位點(diǎn)進(jìn)行突變，即突變模擬發(fā)生磷酸化（S403D和S404D），突變后發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白A 前體主要分散在細(xì)胞質(zhì)中，所以磷酸化影響核纖層蛋白A 前體的細(xì)胞定位[38]。PKC 家族成員磷酸化核纖層蛋白A 除了可以使核膜裂解外還具有其他功能，如核纖層蛋白A的Ig-fold區(qū)域的S525只在細(xì)胞分裂間期才發(fā)生磷酸化，所以并不參與細(xì)胞核的分裂調(diào)控[37]。核纖層蛋白A的S404 可以被S6-kcinaseⅡ磷酸化[39]，并且在各種細(xì)胞中該位點(diǎn)都有被修飾的情況，但是功能還不清楚。

3 核纖層蛋白A 翻譯后修飾之間的相互作用

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，該過程的異常將直接影響蛋白質(zhì)功能的正常執(zhí)行，從而引發(fā)相關(guān)疾病甚至癌癥。核纖層蛋白A的翻譯后修飾可能作用于同一氨基酸殘基，也可能因?yàn)樾揎椇蟾淖兊鞍椎臉?gòu)象或定位而影響其他的翻譯后修飾過程。

Sharma 等[23]在MEFs細(xì)胞中將已報(bào)道的核纖層蛋白A的3個(gè)SUMO 化修飾位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變（核纖層蛋白A-3KR），與未進(jìn)行突變的核纖層蛋白A 分別轉(zhuǎn)染野生型MEFs細(xì)胞和SENP1 突變的MEFs細(xì)胞，檢測(cè)核纖層蛋白A的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染未突變的核纖層蛋白A 相比較，在MEFs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染核纖層蛋白A-3KR后，核纖層蛋白A-3KR表達(dá)下降；與轉(zhuǎn)染未突變的核纖層蛋白A 相比較，在SENP1 突變的MEFs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染核纖層蛋白A-3KR后，核纖層蛋白A-3KR的表達(dá)也是下降的。因此，SUMO 化修飾對(duì)核纖層蛋白A在野生型和SENP1 突變型MEFs細(xì)胞中都具有穩(wěn)定核纖層蛋白A表達(dá)的功能。在野生型MEFs細(xì)胞和SENP1突變的MEFs細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染核纖層蛋白A 或核纖層蛋白A-3KR，SENP1 突變的MEFs細(xì)胞中核纖層蛋白A的表達(dá)都較高。因此，SENP1的缺失可以提高核纖層蛋白A的表達(dá)，同時(shí)核纖層蛋白A 可能還含有別的SUMO 化修飾位點(diǎn)。在野生型MEFs細(xì)胞和SENP1 突變的MEFs細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132，可以提高內(nèi)源核纖層蛋白A蛋白的表達(dá)。核纖層蛋白A 可能會(huì)受到泛素的修飾進(jìn)而發(fā)生泛素-蛋白酶體途徑的降解，所以核纖層蛋白A 進(jìn)行SUMO 化修飾可能具有保護(hù)其不被泛素蛋白酶降解的功能。核纖層蛋白A 作為V 型中間絲，與其他中間絲蛋白結(jié)構(gòu)具有一定的保守性（桿狀結(jié)構(gòu)域高度保守），特別是其N端的16個(gè)氨基酸殘基和C端的30個(gè)氨基酸殘基的保守性最高[40]。已經(jīng)有報(bào)道，高磷酸化的中間絲蛋白經(jīng)常伴隨泛素化的發(fā)生，有觀點(diǎn)提出磷酸化的存在可能具有招募泛素連接酶的能力，因此磷酸化和泛素化之間存在的機(jī)制須進(jìn)一步探討[41]。此外，也有報(bào)道中間絲蛋白的泛素化與蛋白酶體抑制劑具有一定關(guān)系[42]。

4 結(jié)語

核纖層蛋白A 作為核骨架蛋白維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)功能形態(tài)的穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)變化不僅能影響細(xì)胞核的可變形性，也能影響癌細(xì)胞的遷移功能。核纖層蛋白A 翻譯后修飾的過程受到一系列酶的嚴(yán)格調(diào)控，翻譯后修飾影響其表達(dá)、定位以及與其他蛋白的相互作用等。然而核纖層蛋白A的翻譯后修飾在細(xì)胞中的功能，以及核纖層蛋白A 各種翻譯后修飾之間的相互作用關(guān)系都亟需深入挖掘。進(jìn)一步開展核纖層蛋白A的翻譯后修飾研究，對(duì)于深入探究細(xì)胞核結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。