microRNAs調(diào)節(jié)腦卒中后血腦屏障的研究進(jìn)展

楊佳蕾，張秀芬，吳詩(shī)坡，侯利華，尹世敏

1.解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，全軍腦卒中醫(yī)療救治研究中心神經(jīng)內(nèi)科，北京100088；2.解放軍總醫(yī)院 海南醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 三亞572013；3.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；4.國(guó)家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100070

血腦屏障是指腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞及基膜組成的血液與腦組織之間的屏障，對(duì)保持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)腦組織的營(yíng)養(yǎng)與代謝、維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能有重要意義[1]。在眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如腦卒中、阿爾茲海默癥、腦外傷、腦腫瘤、腦小血管病，血腦屏障的結(jié)構(gòu)及功能往往遭到破壞，導(dǎo)致腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腦水腫及脫髓鞘、氧化自由基損傷、神經(jīng)元變性及神經(jīng)細(xì)胞死亡[2-3]。作為我國(guó)居民第一位死亡原因，腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，探討如何有效挽救受損血腦屏障，減輕或修復(fù)腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，具有重要的臨床意義。microRNA（miRNA）是一類(lèi)由19～24個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，如調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化[4]。腦卒中后miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，上調(diào)其中的保護(hù)性miRNA或下調(diào)損傷性miRNA可以起到抗炎、抗凋亡、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，提示miRNA不但是影響腦卒中病理生理過(guò)程的關(guān)鍵分子，而且可以作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)[5]。本文對(duì)miRNA調(diào)節(jié)腦卒中后血腦屏障的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為保護(hù)血腦屏障、減輕腦損傷、改善預(yù)后提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 血腦屏障

血腦屏障是外源物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道屏障，對(duì)進(jìn)出腦組織的物質(zhì)有濾過(guò)和篩選作用，對(duì)維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要意義。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間位于頂部的緊密連接使內(nèi)皮細(xì)胞形成完整的屏障界面，與細(xì)胞底部的黏附連接共同組成連接復(fù)合體。緊密連接蛋白主要包括閉合蛋白（occludins）、密封蛋白（claudins）以及輔助蛋白ZO 等，黏附蛋白主要為鈣黏著蛋白（cadherins）。內(nèi)皮細(xì)胞外周的基膜對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起支撐保護(hù)作用，主要由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等構(gòu)成[6]。任何損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)的疾病，如腦卒中、阿爾茲海默癥、腦外傷、腦腫瘤、腦小血管病，都可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接開(kāi)放、基膜被基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）消化崩解、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突回縮、血腦屏障通透性增加，繼而引發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及大量炎性因子釋放、血管源性以及細(xì)胞源性水腫、神經(jīng)細(xì)胞死亡以及神經(jīng)功能障礙[7]。

2 miRNA

miRNA是一類(lèi)序列高度保守的非編碼RNA，其生物合成是一個(gè)多步驟過(guò)程。在RNA 聚合酶的作用下，DNA 轉(zhuǎn)錄為可長(zhǎng)達(dá)幾千堿基的PrimiRNA，接著由Drosha 復(fù)合物剪切成65～75個(gè)核苷酸、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pre-miRNA；Pre-miRNA被輸出蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿，然后被Dicer 識(shí)別并對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切，形成具有功能的成熟單鏈miRNA。miRNA雖然短小，但是卻可以通過(guò)堿基配對(duì)原則與靶基因的mRNA 3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，抑制靶基因mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶蛋白產(chǎn)量減少，在細(xì)胞代謝、增殖、分化、死亡等各個(gè)生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。一個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也可以受到多個(gè)miRNA的影響，從而構(gòu)成交錯(cuò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。理論上，人類(lèi)基因中可能有超過(guò)三分之一的基因受到miRNA調(diào)控[8]。在病理過(guò)程中，miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，越來(lái)越多的研究關(guān)注到miRNA作為生物標(biāo)志物在疾病早期診斷、判斷疾病分期與病情輕重、監(jiān)測(cè)治療效果與評(píng)價(jià)新療法中的作用。對(duì)miRNA在疾病過(guò)程中發(fā)揮的作用以及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，將有助于發(fā)現(xiàn)更多更優(yōu)的診治靶點(diǎn)[5]。

3 miRNA與腦卒中

腦卒中是一種導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的血管性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中較出血性腦卒中更常見(jiàn)，占腦卒中人群的70%～80%。腦組織缺血缺氧可以導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接受到破壞，導(dǎo)致血管源性水腫，血腦屏障通透性發(fā)生改變，炎性因子浸潤(rùn)、基質(zhì)金屬蛋白酶及環(huán)氧合酶激活、活性氧自由基的產(chǎn)生都影響著腦卒中后血腦屏障損傷的病理進(jìn)程[9]。而在此過(guò)程中，miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)下游分子的表達(dá)影響該病理過(guò)程[10]。

3.1 miRNA與缺血性腦卒中

在缺血性腦卒中后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接往往首先受到影響，miRNA則可以通過(guò)影響緊密連接相關(guān)蛋白（如ZO-1、閉合蛋白和密封蛋白等）影響血腦屏障通透性。既往研究報(bào)道，在體外原代培養(yǎng)人腦血管內(nèi)皮并制作氧糖剝奪模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-155 抑制劑或miR-155，可以調(diào)節(jié)單層血管內(nèi)皮電阻和通透性，轉(zhuǎn)染miR-155 抑制劑組可以顯著提高Claudin-1、ZO-1 等緊密連接蛋白水平，而轉(zhuǎn)染miR-155 組則可以降低上述緊密蛋白表達(dá)[11]。除了體外研究，在體研究也得到近似結(jié)果。給大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端梗阻（dMCAO）的腦梗塞小鼠經(jīng)靜脈注射miR-155 抑制劑，可以顯著提高缺血損傷區(qū)邊沿血流灌注以及微循環(huán)血管的完整性，電鏡檢測(cè)觀察到注射miR-155 抑制劑的小鼠在腦梗塞后毛細(xì)血管的緊密破壞減少，頭顱核磁檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦梗塞損傷區(qū)體積也較對(duì)照組顯著減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 通過(guò)調(diào)控其靶蛋白R(shí)heb 穩(wěn)定了緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1，從而發(fā)揮保護(hù)血腦屏障的作用[12]。miR-210 也可以負(fù)性調(diào)控血腦屏障完整性，經(jīng)側(cè)腦室注射miR-210 導(dǎo)致腦水腫以及IgG 蛋白向腦實(shí)質(zhì)滲透。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-210 可以結(jié)合在閉合蛋白以及β連環(huán)素（β-catenin）mRNA的3'UTR端，降低上述蛋白表達(dá)水平，而抑制miR-210 則起到保護(hù)性作用[13]。除了影響緊密連接相關(guān)蛋白，miRNA也可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞線(xiàn)粒體能量供應(yīng)影響血腦屏障完整性。例如miR-34a 可以減少線(xiàn)粒體氧化磷酸化和三磷酸腺苷的產(chǎn)生，在血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-34a 可以抑制線(xiàn)粒體功能、影響緊密連接蛋白分布、增加血腦屏障通透性[14]。類(lèi)似miR-155、miR-210、miR-34a、miR-143[15]、miR-150[16]也對(duì)血腦屏障的通透性產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控，這也提示抑制負(fù)性miRNA有可能成為保護(hù)血腦屏障的治療方法。

然而，也有一些miRNA可以通過(guò)多種機(jī)制維持血腦屏障完整性。例如，在缺血性腦卒中后血液中及腦組織中miR-132表達(dá)水平發(fā)生變化，給大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）小鼠經(jīng)側(cè)腦室注射miR-132 可以顯著減輕腦梗塞損傷、改善神經(jīng)功能預(yù)后。進(jìn)一步機(jī)制分析提示，miR-132 可以通過(guò)抑制其靶蛋白MMP9 減少緊密連接蛋白VE-鈣黏著蛋白及β連環(huán)素的降解[17]。與之相似，miR-539在腦缺血再灌注模型中表達(dá)量降低，而其靶蛋白MMP-9表達(dá)含量增高導(dǎo)致血腦屏障破壞。在體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞并制作氧糖剝奪模型，通過(guò)添加外源性miR-593 可以顯著改善氧糖剝奪導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷[18]。miR-21 不僅在腦外傷動(dòng)物模型中被檢測(cè)到促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接、穩(wěn)定血腦屏障[19-20]，還有報(bào)道m(xù)iR-21 可以通過(guò)結(jié)合MAP2K3的3'UTR 降低腦梗塞后血腦屏障通透性、減少損傷區(qū)體積、減輕水腫并改善神經(jīng)功能[21]。

3.2 miRNA與出血性腦卒中

盡管出血性腦卒中的發(fā)病率低于缺血性腦卒中，但出血性腦卒中患者腦血管破裂導(dǎo)致血液進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，可以引起顯著的腦腫脹、顱高壓、神經(jīng)功能障礙，出血性腦卒中的死亡率、致殘率往往較高，研究其神經(jīng)保護(hù)策略有重要的臨床意義。既往研究報(bào)道，腦出血患者血漿中miR-126、miR-146a和miR-let-7a 等miRNAs表達(dá)水平降低，其中miR-126表達(dá)水平與預(yù)后情況負(fù)相關(guān)[22]。miR-126 有2種成熟剪切形式，分別為miR-126-3p和miR-126-5p。miR-126-3p 可以通過(guò)負(fù)性調(diào)控PIK3R2 影響血管生成及血管內(nèi)皮完整性[23-24]。在腦出血大鼠模型中，經(jīng)側(cè)腦室定位補(bǔ)充外源性miR-126-3p 可以減輕腦水腫，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活[22]。miR-132 不僅在缺血性腦卒中過(guò)程中對(duì)血腦屏障有保護(hù)作用，有研究發(fā)現(xiàn)其在出血性腦卒中中同樣有保護(hù)效力[25]。該研究采用自體血腦出血模型，用慢病毒表達(dá)miR-132 并定位注射到尾狀核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，外源性表達(dá)miR-132 使炎性因子表達(dá)水平降低，神經(jīng)細(xì)胞死亡減少，緊密連接蛋白表達(dá)水平升高，神經(jīng)功能得以改善。miR-27a-3p 則是通過(guò)直接調(diào)節(jié)AQP11 影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。AQP11 是水通道蛋白家族的一員，盡管相較于表達(dá)豐度都較高的AQP4和AQP1，AQP11的表達(dá)豐度較低，但AQP11 可以同時(shí)調(diào)節(jié)水和糖在血液-腦組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。腦出血后miR-27a-3p 水平降低，導(dǎo)致AQP11 異常上調(diào)，從而影響血腦屏障正常通透轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上所述，miRNA作為表觀基因修飾的重要組成部分，在腦卒中后血腦屏障損傷過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，為治療干預(yù)提供了多重靶點(diǎn)[27]。采用具有較高載藥量、良好生物相容性、主動(dòng)靶向性、低毒性的遞送方式，外源性補(bǔ)充保護(hù)性miRNA，可以保護(hù)血管內(nèi)皮形態(tài)，減少緊密連接破壞，維持血腦屏障通透性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，減少腦組織損傷體積，改善腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)[28]。因此，進(jìn)一步探討如何安全、高效地外源性補(bǔ)充保護(hù)性miRNA、抑制損傷性miRNA有長(zhǎng)遠(yuǎn)的臨床意義。