硝酸鹽調(diào)控豆科植物與根瘤菌共生固氮的機(jī)制研究

羅振鵬 謝芳

（1. 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心 植物生理生態(tài)研究所 植物分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

氮是生命活動(dòng)的必須元素，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的大量營(yíng)養(yǎng)元素。氮在自然界中主要以氮?dú)獾男问酱嬖?，氮?dú)夂控S富卻不能被植物直接吸收利用，而是需要被固定還原為氨，才能進(jìn)一步為生物所利用。生物固氮，特別是豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮，是自然界中固氮效率最高、也最具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的體系。

豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮是一個(gè)非常復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，需要共生雙方的“分子對(duì)話”和信號(hào)交流［1-2］。豆科植物通過(guò)與根瘤菌間的共生固氮作用獲取生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮素，在缺乏氮素的條件下生長(zhǎng)。但共生固氮過(guò)程也是一個(gè)非常耗能的過(guò)程，需要消耗植物大量的生物能。為了平衡生長(zhǎng)和固氮，豆科植物演化出一套有效的機(jī)制來(lái)形成“合適”的根瘤數(shù)目。目前的研究表明，豆科植物可以通過(guò)結(jié)瘤自主調(diào)控（Autoregulation of nodulation，AON）途徑抑制根瘤共生［3-4］。此外，當(dāng)土壤中存在充足的氮素，豆科植物會(huì)選擇直接吸收外界環(huán)境中的氮而抑制共生固氮［5］。當(dāng)土壤中存在高濃度的硝酸鹽時(shí)，共生過(guò)程會(huì)被抑制，表現(xiàn)為侵染線、根瘤數(shù)目顯著減少，根瘤形成小且沒(méi)有固氮能力的白色根瘤［6-8］。通過(guò)遺傳、嫁接及分根等實(shí)驗(yàn)表明硝酸鹽抑制結(jié)瘤涉及局部和系統(tǒng)性信號(hào)［9-10］。NLPs（NIN-like proteins）轉(zhuǎn)錄因子在根部發(fā)揮功能，通過(guò)調(diào)控下游靶標(biāo)基因的方式參與硝酸鹽抑制共生固氮過(guò)程［11］，而AON途徑被硝酸鹽信號(hào)激活后通過(guò)系統(tǒng)性調(diào)控的方式抑制根瘤的形成［8，12］。而本文將結(jié)合最近在模式植物百脈根（Lotus japonicus）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的一些研究結(jié)果，討論NLPs轉(zhuǎn)錄因子、AON途徑如何協(xié)調(diào)參與硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮過(guò)程。

1 結(jié)瘤自主調(diào)控（AON）參與硝酸鹽抑制結(jié)瘤

豆科植物通過(guò)與根瘤菌共生互作的方式獲得了生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮素，但共生固氮也會(huì)消耗植物大量的碳源。為了平衡生長(zhǎng)和固氮，豆科植物演化出一套系統(tǒng)性調(diào)控根瘤數(shù)目的負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)途徑，稱為結(jié)瘤自主調(diào)控［3，13-14］。AON途徑相關(guān)的基因發(fā)生突變，植物根瘤數(shù)目會(huì)失去了控制，就會(huì)表現(xiàn)出超結(jié)瘤（Hypernodulation）的表型，導(dǎo)致過(guò)度固氮并消耗植物大量的光合產(chǎn)物，植物表現(xiàn)出生長(zhǎng)矮小等表型［5，15-17］。AON途徑涉及植物地下和地上的長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)。在百脈根的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)瘤因子信號(hào)激活NIN（Nodule Inception）的表達(dá)，NIN作為轉(zhuǎn)錄因子激活CLE-RS1（CLE-Root Signal 1）和CLERS2的表達(dá)［18］。CLE-RS1/2短肽被剪切及加工后通過(guò)木質(zhì)部從根部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，被地上部的類受體激 酶（Leucine-rich repeat（LRR）-type receptor-like kinase）HAR1（Hypernodulation Aberrant Root 1）所識(shí)別［5，19］，隨后激活 SDI（Shoot-Derived Inhibitor）信號(hào)從地上部轉(zhuǎn)移至根部抑制根瘤的形成［20］。Kelch-repeat的F-box蛋白TML（Too Much Love）位于HAR1的下游，在根部負(fù)調(diào)控根瘤的數(shù)目［20］。

AON途徑在豆科植物中十分保守，在蒺藜苜蓿、豌豆（Pisum sativum）、大豆（Glycine max）和菜豆（Phaseolus vulgaris）中均發(fā)現(xiàn)了HAR1的同源 基 因， 包 括MtSUNN（Super numeric nodules）、PsSYM29、GmNARK（Nodule autoregulation receptor kinase）和PvNARK［21-24］，這些基因突變后都表現(xiàn)出相似的超結(jié)瘤表型，以及受根瘤菌誘導(dǎo)的CLE短肽：MtCLE12、MtCLE13和 GmRIC1（Rhizobia induced CLE 1）、GmRIC2、PvRIC1 和 PvRIC2 等［24-27］。最近的研究表明，根瘤菌誘導(dǎo)豆科植物地上部miR2111的表達(dá)，隨后miR2111通過(guò)韌皮部從地上運(yùn)輸?shù)礁?，與TML結(jié)合從而調(diào)控根瘤的形成［28］。

有意思的是，AON途徑中的突變體在根瘤數(shù)目上也表現(xiàn)出一定的硝酸鹽耐受性（Nitrate tolerance）［4］。通過(guò)在高硝酸鹽條件下篩選大豆突變體，得到了一批硝酸鹽不敏感的突變體nts（Nitrate tolerant symbiosis）。這些突變體在高硝酸鹽條件下依然具有超結(jié)瘤的表型［29］。通過(guò)對(duì)這些突變體的基因克隆發(fā)現(xiàn)，它們都是由類受體激酶GmNARK基因突變導(dǎo)致［23］。隨后在其它豆科植物中也發(fā)現(xiàn)了與AON途徑相關(guān)的突變體對(duì)硝酸鹽不敏感，在高硝酸鹽條件下依然表現(xiàn)出超結(jié)瘤表型。例如，百脈根中的har1、klv（klavier）、plenty，蒺藜苜蓿中的sunn、lss（like sunn supernodulator）、rdn1， 豌 豆 中的sym29等［5，15，17，21，30-32］。除此之外，一些 CLE短肽也受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)，如百脈根中的CLE-RS2和CLE-RS3［33］。遺傳和嫁接實(shí)驗(yàn)表明，CLE-RS2過(guò)表達(dá)引起根瘤數(shù)目降低，且依賴于植物地上部受體HAR1［33］。而大豆中的NIC1（Nitrate induced CLE 1）同樣受硝酸鹽誘導(dǎo)，但NIC1在根部發(fā)揮功能，且依賴于植物地下部的受體NARK［25］。以上結(jié)果都表明AON途徑在硝酸鹽抑制結(jié)瘤中起著重要的作用。

高濃度的硝酸鹽除了抑制根瘤的形成，也會(huì)抑制根瘤發(fā)育以及固氮酶活性［8］。Cabeza等［34］發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿的根瘤在處理硝酸鹽后，編碼豆血紅蛋白（Leghemoglobins）的相關(guān)基因顯著下調(diào)，固氮酶需要在低氧的環(huán)境才能維持活性，而豆血紅蛋白可以與氧氣結(jié)合，為固氮酶提供低氧的環(huán)境。這暗示著硝酸鹽抑制固氮酶活性可能是通過(guò)影響豆血紅蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致根瘤內(nèi)氧氣濃度過(guò)高，引起固氮酶的活性下降。除此之外，高濃度的硝酸鹽還會(huì)抑制侵染線的形成，影響侵染效率［6］。而AON途徑中的sunn、rdn1和har1等突變體雖然在高硝酸鹽條件下依然能形成過(guò)量的根瘤，但根瘤發(fā)育受到限制，只能形成大量小且沒(méi)有固氮能力的白色根瘤。這說(shuō)明除了AON途徑外，還存在著其它途徑參與硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮過(guò)程。

2 NIN-like proteins（NLPs）轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)硝酸鹽抑制結(jié)瘤

NIN是第一個(gè)被分離鑒定到的豆科植物基因，協(xié)同調(diào)控根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)育［35］。近些年在擬南芥及其它植物中的研究發(fā)現(xiàn)，NIN-like protein（NLPs）在硝酸鹽信號(hào)途徑中具有重要作用［36］。NLPs與 NIN 一 樣 C端 都 具 RWP-RK 和PB1結(jié)構(gòu)域［37］。擬南芥基因組中存在9個(gè)NLP基因［37］。NLP7感受到硝酸鹽后，NLP7蛋白從細(xì)胞質(zhì)中穿梭到細(xì)胞核，從而調(diào)控硝酸鹽信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)［38］。NLP7作為響應(yīng)硝酸鹽信號(hào)的核心轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合包括硝酸鹽吸收、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，激活這些基因的表達(dá)，從而向下傳遞硝酸鹽信號(hào)［38-39］。NLP8在感受硝酸鹽信號(hào)后，能夠直接激活A(yù)BA水解酶CYP707A2（cytochrome P450，family 707，subfamily A，polypeptide 2）的表達(dá)，從而降低ABA含量，打破種子休眠，該研究表明NLP8參與硝酸鹽調(diào)控種子萌發(fā)的過(guò)程。與NLP7不同的是，NLP8定位于細(xì)胞核，其定位不受硝酸鹽影響［40］。

最近，在蒺藜苜蓿和百脈根中分別發(fā)現(xiàn)NLPs轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控硝酸鹽抑制根瘤共生的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Lin等［11］研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿中存在5個(gè)NLP基因，5個(gè)NLP均可以與NIN蛋白相互作用。他們對(duì)這5個(gè)NLP基因進(jìn)行RNA干擾發(fā)現(xiàn)，除了NLP2外，其它4個(gè)NLP基因的下調(diào)，在結(jié)瘤上均表現(xiàn)出一定的硝酸鹽耐受性。隨后獲得的兩個(gè)NLP1 Tnt1插入突變體在氮素缺乏的條件下，形成與野生型一致的根瘤數(shù)目和可以正常固氮的根瘤。但在高濃度硝酸鹽存在的條件下，nlp1在根瘤數(shù)目、侵染線的形成以及固氮酶活性和野生型相比都有顯著的提高，說(shuō)明NLP1在硝酸鹽抑制共生固氮的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與擬南芥中的NLP7一樣，NLP1能夠響應(yīng)硝酸鹽信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核中。NLP1通過(guò)C端的PB1結(jié)構(gòu)域與NIN互作，并能抑制NIN對(duì)下游靶標(biāo)基因CRE1、NF-YA1的激活。該研究表明NLP1感受硝酸鹽信號(hào)之后，通過(guò)干擾NIN的功能從而抑制共生過(guò)程。然而，NLP結(jié)合的NRE（Nitrate response element）元件與NIN結(jié)合元件NBS序列較為相似，體外EMSA實(shí)驗(yàn)表明NIN也可以直接結(jié)合到NRE上［41］。過(guò)表達(dá)NIN會(huì)抑制響應(yīng)硝酸鹽信號(hào)基因的表達(dá)［42］，說(shuō)明NIN和NLPs存在著相互競(jìng)爭(zhēng)靶標(biāo)基因的可能性。因此，NLP1抑制NIN對(duì)下游靶標(biāo)基因的激活，是因?yàn)榈鞍讖?fù)合體的形成減弱了NIN對(duì)下游靶標(biāo)基因的激活能力，還是二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到NIN的靶標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)并減弱了NIN對(duì)靶標(biāo)基因的激活能力，還有待于進(jìn)一步研究。

此外，Nishida等［12］在百脈根中也發(fā)現(xiàn)了NRSYM1（LjNLP4）參與硝酸鹽抑制共生固氮過(guò)程。與蒺藜苜蓿nlp1突變體表型一樣，nrsym1（nitrate unresponsive symbiosis 1）突變體在根瘤數(shù)目，侵染線的形成以及固氮酶活性表現(xiàn)出很強(qiáng)的硝酸鹽耐受性。NRSYM1同樣能響應(yīng)硝酸鹽入核，隨后結(jié)合在靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的NRE元件上激活包括硝酸鹽信號(hào)NIA（Nitrate reductase）、NIR1（Nitrite reductase 1）以及與AON途徑相關(guān)的CLE-RS2基因的表達(dá)，然后通過(guò)HAR1介導(dǎo)的AON途徑系統(tǒng)性抑制根瘤形成。雖然Nishida等通過(guò)遺傳、生化和嫁接實(shí)驗(yàn)證明了硝酸鹽能夠誘導(dǎo)NRSYM1入核，激活CLE-RS2的表達(dá)，隨后通過(guò)AON途徑抑制根瘤數(shù)目。但AON途徑只參與硝酸鹽抑制根瘤數(shù)目，不參與抑制其它共生過(guò)程［8，12］。而NRSYM1除了調(diào)控根瘤數(shù)目以外，還參與了硝酸鹽抑制結(jié)瘤的其它共生過(guò)程，包括侵染線的形成、根瘤發(fā)育及固氮酶活性。這說(shuō)明除了AON途徑以外，NRSYM1還能通過(guò)其它途徑激活不同下游的靶標(biāo)基因介導(dǎo)硝酸鹽抑制共生固氮過(guò)程。

3 CEP短肽在硝酸鹽抑制結(jié)瘤中的作用

除了AON途徑系統(tǒng)性負(fù)調(diào)控根瘤數(shù)目以外，近年來(lái)還在蒺藜苜蓿中發(fā)現(xiàn)CRA2（Compact Root Architecture 2）介導(dǎo)的正向調(diào)控結(jié)瘤途徑，CRA2也編碼一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)的類受體激酶［43］。cra2突變體側(cè)根數(shù)量顯著增加，但根瘤數(shù)目顯著減少［43］。嫁接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地上部CRA2控制結(jié)瘤，而地下部CRA2控制側(cè)根的形成［43］。Mu 等［36］發(fā)現(xiàn)在蒺藜苜蓿中，CRA2與SUNN介導(dǎo)的AON途徑在調(diào)控根瘤數(shù)目方面相互獨(dú)立；cra2突變體在根瘤數(shù)目上表現(xiàn)出對(duì)硝酸鹽敏感，但cra2 sunn雙突變體在根瘤數(shù)目上表現(xiàn)出硝酸鹽耐受性。CRA2是擬南芥中CEP（C-terminally Encoded Peptide） 受 體CEPR1（CEP Receptor 1）和CEPR2在蒺藜苜蓿中的同源基因［44］。CEP被低氮誘導(dǎo)表達(dá)，隨后被剪切加工為成熟的短肽后，從根部轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部被受體CEPR1和CEPR2識(shí)別，激活地上部信號(hào)CEPD（Downstream of CEP）基因的表達(dá)，CEPD短肽通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至地下正向調(diào)控NRT2.1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)植物對(duì)硝酸鹽的吸收［44-45］。與擬南芥中一樣，蒺藜苜蓿中的CEP基因在低氮條件下被誘導(dǎo)表達(dá)。過(guò)表達(dá)CEP1基因或體外添加CEP1短肽都能增加根瘤數(shù)目及抑制側(cè)根的形成［46］，而在cra2突變體中則不能，說(shuō)明CRA2極有可能是CEP的受體［46-47］。此外，過(guò)表達(dá)CEP1基因或體外添加CEP1短肽均能提高根瘤對(duì)硝酸鹽的耐受性，根瘤數(shù)目與對(duì)照相比有顯著的提高［46］，而且CEP1短肽提高蒺藜苜蓿根瘤對(duì)硝酸鹽的耐受性依賴于地上部的CRA2的存在（本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)）。施加濃度梯度硝酸鹽實(shí)驗(yàn)表明，cra2突變體對(duì)硝酸鹽更加敏感，在低濃度硝酸鹽處理下，根瘤數(shù)目顯著降低（本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)）。這些研究結(jié)果表明CRA2所介導(dǎo)的正向調(diào)控結(jié)瘤途徑和CEP1都參與了硝酸鹽抑制結(jié)瘤的過(guò)程。察到，但其中的分子機(jī)制還不十分清楚。硝酸鹽信號(hào)組分NLPs廣泛參與了硝酸鹽抑制共生固氮過(guò)程，包括侵染線的形成、根瘤發(fā)育、根瘤數(shù)目及固氮酶活性。目前的研究結(jié)果表明，NLPs通過(guò)AON途徑系統(tǒng)性抑制根瘤數(shù)目，但NLPs是否與另一系統(tǒng)性途徑CRA2途徑存在著cross-talk目前還不清楚。嫁接結(jié)果表明NLPs在根部發(fā)揮作用，暗示著NLPs可能介導(dǎo)局部信號(hào)參與硝酸鹽抑制共生過(guò)程。NLPs雖然在硝酸鹽抑制根瘤共生中發(fā)揮重要作用，但其它硝酸鹽信號(hào)組分是否參與硝酸鹽抑制結(jié)瘤還需要進(jìn)一步的探究。此外，植物激素乙烯也參與硝酸鹽抑制共生固氮的過(guò)程。乙烯負(fù)向調(diào)控共生過(guò)程，外部施加乙烯會(huì)抑制根瘤菌的侵染和結(jié)瘤［48］。乙烯信號(hào)途徑組分EIN2（Ethylene INsensitive 2）突變體Mtsickle具有超侵染和超結(jié)瘤的表型［49］。從紫花苜蓿（M.sativa）中的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽處理會(huì)增加植物根部乙烯的含量，而乙烯合成抑制劑AVG處理可以提高結(jié)瘤的硝酸鹽耐受性［50］。這些結(jié)果都說(shuō)明乙烯在硝酸鹽抑制結(jié)瘤的過(guò)程中發(fā)揮作用。然而乙烯如何參與硝酸鹽抑制結(jié)瘤，以及與其它途徑是否存在著聯(lián)系還需要進(jìn)一步的研究。

豆科作物可以通過(guò)共生固氮來(lái)滿足植物對(duì)氮的需求，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以減少對(duì)豆科作物氮肥的施用量。但由于片面追求作物產(chǎn)量而過(guò)度施加氮肥導(dǎo)致大量的氮素殘留在土壤中，抑制了豆科植物與根瘤菌間的共生固氮作用。了解硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌共生固氮的機(jī)制可以避免施用過(guò)多的氮肥，同時(shí)也可以通過(guò)分子育種和基因工程手段提高豆科作物共生固氮的硝酸鹽耐受性，提高共生固氮效率以減少無(wú)機(jī)氮肥的使用，從而改善土壤環(huán)境。

4 總結(jié)及展望

高濃度的氮抑制根瘤的形成和固氮酶活性，這被稱為 “氮阻遏”現(xiàn)象。盡管這一現(xiàn)象很早就被觀