藻類光遺傳學(xué)的研究進(jìn)展

任慶敏，王寅初

(中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所， 煙臺(tái) 264003)

藻類是光合自養(yǎng)的低等生物，能感知自然界中光質(zhì)、光強(qiáng)和光照方向的變化。藻類通過復(fù)雜的光感知系統(tǒng)感知環(huán)境中光的變化，從而適應(yīng)性地改變其生理和發(fā)育過程。藻類具有多種類型的光受體，使得它們能夠調(diào)節(jié)各種光依賴性的細(xì)胞和生理過程從而改變它們的行為。此外，波長(zhǎng)或光譜組成的變化也能夠調(diào)節(jié)其發(fā)育和生理過程，例如晝夜節(jié)律。因此，對(duì)潛在的趨光和避光反應(yīng)的機(jī)制以及其他光依賴性的過程的深入探索有助于藻類光生物學(xué)的發(fā)展。

經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的研究，已經(jīng)基本了解藻類在生理、生物物理和形態(tài)學(xué)方面對(duì)光的響應(yīng)過程。然而，直到21世紀(jì)初，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，才發(fā)現(xiàn)光介導(dǎo)的行為反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白。光敏感通道蛋白-1(Channelrhodopsin-1, ChR1)和光敏感通道蛋白-2(Channelrhodopsin-2,ChR2)，這兩種從萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)光受體，參與了單細(xì)胞綠藻的光感知和光誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)[1-4]。經(jīng)藍(lán)光照射后的光門控離子通道能夠使細(xì)胞去極化[1-2]。之后，新的光敏感通道蛋白的發(fā)現(xiàn)和新的修飾變體的設(shè)計(jì)促使該領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，為在時(shí)間和空間上精確地控制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。

光遺傳學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展使光敏感結(jié)構(gòu)域的需求日益增加，比如開發(fā)具有其他吸收光譜和新的光電性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，以應(yīng)用于光遺傳學(xué)和合成生物學(xué)。目前這一領(lǐng)域最熱門的是光控酶，例如光激活的鳥苷酸或腺苷酸環(huán)化酶。這些酶可以以光依賴性方式改變信號(hào)分子cGMP或cAMP的水平。另一類有前景的具有酶活性的光感受器來源于組氨酸激酶視紫紅質(zhì)的家族，其發(fā)現(xiàn)于團(tuán)藻和衣藻。紫外/藍(lán)光敏感光感受器使光遺傳學(xué)不僅應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)，還能通過解鎖許多其他細(xì)胞過程和參數(shù)進(jìn)行光遺傳學(xué)干預(yù)，包括基因表達(dá)、DNA重組、亞細(xì)胞定位、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)、細(xì)胞凋亡和酶活性[5]。新的光敏感工具的發(fā)現(xiàn)有力促進(jìn)了光遺傳技術(shù)的發(fā)展，而藻類無疑是光敏蛋白的一個(gè)重要來源。

1 光敏感蛋白

光敏感蛋白是一類發(fā)現(xiàn)于單細(xì)胞微生物的視蛋白，可以感知不同波長(zhǎng)的光的刺激，并對(duì)該光學(xué)刺激產(chǎn)生一系列反應(yīng)。光敏感蛋白是膜整合蛋白(如光敏感通道蛋白)或細(xì)胞質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)(如光敏色素)，通常由蛋白質(zhì)部分和非蛋白質(zhì)光傳感器組成，其吸收光子并直接或間接產(chǎn)生生物效應(yīng)。

光敏感蛋白可以分為3類：紅/遠(yuǎn)紅光吸收的光敏感蛋白(例如光色素)，UV-A/藍(lán)光吸收的光敏感蛋白(如向光素和隱花色素)和UV-B-sensing(如UVR8)光敏感蛋白。這些光感受器已經(jīng)被證實(shí)調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生期間的大量基因表達(dá)[5]。光受體介導(dǎo)多種方式的基因表達(dá)調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄、分化、翻譯和翻譯后，最終誘導(dǎo)適應(yīng)性或發(fā)育性光形態(tài)反應(yīng)。此外，最近的報(bào)告表明，組織或發(fā)育調(diào)節(jié)的光感受器或相關(guān)信號(hào)成分的表達(dá)以組織特異性方式觸發(fā)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化[6]。

自1971年細(xì)菌視紫紅質(zhì)(Bacteriorhodopsin，BR)首次被報(bào)道后，各種特性不同、激活波長(zhǎng)不同的光敏感蛋白也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如鹽視紫紅質(zhì)(Halorhodopsin，HR)、通道視紫紅質(zhì)(Channelrhodopsin，ChR)等，但在2005年Lopez-juez等[7]證明了綠藻來源的視蛋白可以使神經(jīng)元對(duì)光產(chǎn)生應(yīng)答后，光遺傳學(xué)才首次引起人們的普遍重視。

用于激活神經(jīng)元的光敏感通道蛋白ChR2，最早從萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)人為突變、修飾，改造成適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、表達(dá)穩(wěn)定對(duì)細(xì)胞無毒的工具。該蛋白在藍(lán)光的激發(fā)下通道會(huì)快速打開，滲透吸收一價(jià)和二價(jià)陽離子，但是其對(duì)不同陽離子的通透性并不相同，ChR2對(duì)Ca2+的通透性最大，形成光電流的主要離子為Ca2+[2]。

光遺傳學(xué)中也使用了其他一些來自于藻類的光敏感蛋白，包含CyChR1、CraChR2、MChR1、DChR以及VChR1等。Banghart等人在隱芽藻類中發(fā)現(xiàn)了天然存在的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道：陰離子通道視紫紅質(zhì)(Anion Channel Rhodopsins, ACRs)[8]，ACRs能夠嚴(yán)格地傳導(dǎo)陰離子，完全阻止質(zhì)子及更大的陽離子通過，所以能實(shí)現(xiàn)快速超極化，因此它擁有前所未有的光敏感度和時(shí)間精度。第一種定位于真核細(xì)胞的質(zhì)膜的藻類離子泵視紫紅質(zhì)發(fā)現(xiàn)于南極藻Coccomyxasubellipsoidea中，其僅通過光照可以復(fù)原(沉默)神經(jīng)元活動(dòng)[9]。

光敏感蛋白不僅能興奮靶細(xì)胞，另外還有對(duì)其具有抑制作用的光敏感通道蛋白，常用的抑制性光敏感蛋白有鹽視紫紅質(zhì)(HaloR、NpHR)和古紫紅質(zhì)(Archaerhodopsin-T，ArchT)[9]。如NpHR，為氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)視紫紅質(zhì)蛋白，來源于嗜鹽堿單孢菌，可被黃光激活，泵入氯離子使細(xì)胞膜超極化從而抑制其興奮性[10]。

2 藻類光受體在體內(nèi)的功能

藻類具有高度復(fù)雜和多樣化的隱花色素光受體，藻類光受體包括最初在高等植物中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典光感受器(即向光素、細(xì)胞色素、光敏色素和UV-B光受體)，用作光門控離子通道的視紫質(zhì)樣光受體，以及其他光受體家族。

藻類必須根據(jù)光來優(yōu)化它們的光合活性以實(shí)現(xiàn)光合作用高效化，許多細(xì)胞生理過程包括性發(fā)育、晝夜節(jié)律、氮和脂質(zhì)代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化都由光調(diào)節(jié)[11-12]。

向光素的光感受器是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由藍(lán)光激活，藍(lán)光可以誘導(dǎo)藍(lán)藻細(xì)胞分裂的延遲[13]，并參與控制衣藻的性發(fā)育和細(xì)胞大小過程。由于衣藻中的向光素的非光化學(xué)淬滅(NPQ)過程，光感受器、光合作用和光保護(hù)作用之間存在分子聯(lián)系，而且除了光，下游代謝也會(huì)影響這種適應(yīng)過程[14]。向光素的感光細(xì)胞也參與藍(lán)光介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物的積累變化，這是負(fù)責(zé)葉綠素和類胡蘿卜素生物合成的酶產(chǎn)生的[15]。在多細(xì)胞藻團(tuán)藻中，向光素的轉(zhuǎn)錄在小的深綠色的生殖細(xì)胞中比在大的中更易表達(dá)。

藻類隱花色素家族一般是藍(lán)光受體，它們參與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)以及DNA修復(fù)。在衣藻中，隱花色素參與調(diào)節(jié)各種途徑的基因的轉(zhuǎn)錄水平，這些基因以各種方式響應(yīng)藍(lán)光和紅光[16]。植物隱花色素和CPF1是UVA/藍(lán)光受體，而動(dòng)物樣隱花色素幾乎可以響應(yīng)整個(gè)可見光譜，包括紅光。因此，根據(jù)植物隱花色素、動(dòng)物樣隱花色素和CPF1的可見光和紅外光譜特征能夠揭示對(duì)光的結(jié)構(gòu)響應(yīng)[17]。

在團(tuán)藻中，這種感光器在生殖細(xì)胞中高度表達(dá)，并表現(xiàn)出較高的光合活性。光敏感通道蛋白，屬于I型視紫紅質(zhì)，參與衣藻的趨光性或避光反應(yīng)[3, 18]。VChR1被假定為營(yíng)養(yǎng)條件下趨光性的主要光受體[19]。另外4種視紫紅質(zhì)樣光受體，被稱為組氨酸激酶視紫紅質(zhì)，已在團(tuán)藻和衣藻基因組中被鑒定。這些光受體響應(yīng)光刺激或其他環(huán)境刺激(如溫度)可以改變cAMP或cGMP的濃度。cAMP被假定為團(tuán)藻細(xì)胞內(nèi)的第二信使，能針對(duì)誘導(dǎo)物的存在而觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致性發(fā)育。但cAMP在團(tuán)藻中是否參與性分化是有爭(zhēng)議的。cAMP(或cGMP)不僅激活交配反應(yīng)也能激活所有必要的反應(yīng)。cAMP介導(dǎo)的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和cAMP控制的離子通道都與衣藻的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[20]。在團(tuán)藻中，丁酰cAMP增加之后雄配子體就解體了[21]。因此，對(duì)組氨酸激酶視紫紅質(zhì)的有關(guān)性分化功能的研究具有一定的意義。

團(tuán)藻生活的自然環(huán)境中夏季溫度的升高會(huì)作為一種環(huán)境刺激使其從無性到有性發(fā)展。保守視紫紅質(zhì)域的組氨酸激酶視紫質(zhì)可以檢測(cè)某些波長(zhǎng)之間光屬性的變化，導(dǎo)致那些進(jìn)行無性生殖的單倍體物種中二倍體受精卵的基因重組。這可能是由于反應(yīng)調(diào)節(jié)器可激活響應(yīng)域的鳥苷酸和腺苷酸環(huán)化酶然后產(chǎn)生cGMP/cAMP。在團(tuán)藻中，性發(fā)育不僅發(fā)生在溫度增加時(shí)，還發(fā)生在抗氧化反應(yīng)中。cAMP/cGMP觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子可能參與生長(zhǎng)過程中細(xì)胞特異性基因表達(dá)的調(diào)控[23]。此外，在衣藻中cAMP依賴的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為參與cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， Nedelcu等人發(fā)現(xiàn)cAMP水平增加可能是由于視紫紅質(zhì)的激活引起的[24]。

3 藻類光遺傳學(xué)的應(yīng)用

光敏感通道蛋白的細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子可以激活空間和時(shí)間分辨率極高的特定類型的神經(jīng)元。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室目前使用的是來自衣藻的野生型光敏感通道蛋白-2，其吸收的藍(lán)色光峰值約為470 nm，但越來越多的證據(jù)表明來自其他藻類的光敏感通道蛋白(如來自團(tuán)藻的光敏感通道蛋白)也在神經(jīng)生物學(xué)中有巨大的應(yīng)用潛力。如團(tuán)藻光敏感通道蛋白-1在大約520 nm的峰處紅移，因?yàn)榧t光比藍(lán)光危害小，因此，它似乎更適宜應(yīng)用于動(dòng)物和人類模型。在過去幾年中，根據(jù)團(tuán)藻和衣藻中已公開的光敏通道蛋白序列的相似性，在各種藻類物種中鑒定出了幾種其他的光敏感通道蛋白。在鞭毛藻Mesostigmaviride中發(fā)現(xiàn)了一種紅移的光敏感通道蛋白，MChR1，其在520 nm(在中性pH值下)有峰值[25]。在海藻Platymonassubcordiformis中，鑒別出一種峰值在437 nm(在中性pH值)的高效藍(lán)移光敏感通道蛋白[26]。它們?cè)诠膺z傳學(xué)中都有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

此外，衣藻光敏感通道蛋白-1和團(tuán)藻光敏感通道蛋白-1的嵌合體被用于生成新的高效色彩調(diào)節(jié)光敏感通道蛋白。這些嵌合的光敏感通道蛋白具有較大的光電流，最大吸收波長(zhǎng)范圍為526 nm到545 nm[27]。

另一種類型的藻類視紫紅質(zhì)樣感光器——組氨酸激酶的視紫紅質(zhì)家族，可用于控制光遺傳學(xué)應(yīng)用中的細(xì)胞過程。這些光控酶可以根據(jù)光來改變信號(hào)分子的水平，例如cAMP。因此，它們也適合作為利用外部光刺激來操縱動(dòng)物行為的光遺傳學(xué)工具。但是由于這些光感受器中的大的蛋白質(zhì)由4個(gè)亞基組成，使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)及純化復(fù)雜。此外，組氨酸激酶視紫紅質(zhì)的功能還包括吸收光譜、光電流性質(zhì)、酶活性和生物功能。

一些最近的研究表明，光敏感蛋白也可以用來控制蛋白質(zhì)之間的相互作用，例如植物光敏色素，已經(jīng)成功地用于控制紅色和遠(yuǎn)紅光下的基因表達(dá)[28]。利用藍(lán)光誘導(dǎo)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了萊茵衣藻中靶基因表達(dá)的光遺傳學(xué)調(diào)控從而可以誘導(dǎo)產(chǎn)氫[29]。

隱花色素和與之相互作用的CIBI也是用藍(lán)光控制基因表達(dá)的藍(lán)光受體，它們被用于開發(fā)了具有光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子(LITE)的光遺傳學(xué)雙雜交系統(tǒng)。這種LITE系統(tǒng)可用于基因轉(zhuǎn)錄的可逆激活[29]。

4 展望

以基因工程的方法將光敏感通道蛋白轉(zhuǎn)入神經(jīng)細(xì)胞，使神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)藍(lán)光照射而興奮，經(jīng)黃光照射則抑制，此光感基因調(diào)控技術(shù)利用不同波長(zhǎng)的光可實(shí)現(xiàn)活體水平神經(jīng)細(xì)胞精確調(diào)控[30]。

隨著多種特性不同、被激活波長(zhǎng)不同的光敏感蛋白的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與豐富，采用光照以精準(zhǔn)控制并調(diào)控細(xì)胞的光遺傳學(xué)技術(shù)也得到了迅速發(fā)展。光遺傳學(xué)最初被用作神經(jīng)元的前體，現(xiàn)在該技術(shù)可用于操縱多種系統(tǒng)，例如心房心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在多種細(xì)胞和多種疾病的研究與治療中表現(xiàn)出極大的潛力[31]。

在未來，重點(diǎn)可以放在新的光受體的深入研究上，包括它們的精確的(酶)活性、吸收性能、光電性能和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。如果能夠在藻類中發(fā)現(xiàn)新的光受體，那將對(duì)之后的深入研究帶來巨大的影響。這對(duì)于揭示某些分子作用機(jī)制十分有益，甚至可以用作光敏蛋白基于結(jié)構(gòu)的工程基礎(chǔ)。我們還需要鑒定光受體中的相互作用對(duì)，這不僅有利于進(jìn)一步了解光受體信號(hào)網(wǎng)而且對(duì)合成生物學(xué)和光遺傳學(xué)的進(jìn)展是非常重要的。