重組雞痘病毒疫苗的研制現(xiàn)狀

李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶400016

雞痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）引起的雞痘是一種禽類傳染性疾病，可用FPV 的282E4 株、FP9株和TROVAC 株等減毒株進行免疫預(yù)防。雞痘病毒的基因組大約300 kb 大小，含有250 多個開放讀框（ORF），存在大量復(fù)制非必需區(qū)（nonessential region，NER），可插入25～30 kb 的外源基因而不影響雞痘病毒的感染性，是一種有希望的疫苗載體[1-3]。pFBLacZ、pFBS7（LLEE）和pN11SEF 是雞痘病毒的高效表達載體[4-6]，為構(gòu)建重組雞痘病毒提供了有利的工具。pSY683-EGFP、pSY681-GFP和pTKE3-EGFP 等重組質(zhì)?？梢员磉_綠色熒光蛋白（GFP）或增強型綠色熒光蛋白（EGFP），為篩選重組雞痘病毒提供了方便[7-9]。國內(nèi)外學(xué)者報道了大量重組雞痘病毒疫苗，這些病原體包括丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、傳染性喉支氣管炎病毒、馬立克病病毒、新城疫病毒、火雞鼻支氣管炎肺病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、傳染性法氏囊病病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、禽流感病毒、人乳頭瘤病毒16 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、傳染性支氣管炎病毒、牛痘病毒、出血性腸炎病毒、狂犬病毒、豬園環(huán)病毒Ⅱ型、番鴨細小病毒、禽艾美球蟲、雞敗血支原體、惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲等。本文綜述以雞痘病毒為傳遞載體的病原體疫苗的研制現(xiàn)狀。

1 重組雞痘病毒抗黃病毒

1.1 丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）基因組中的C 區(qū)編碼P21、P19 和P16 蛋白，E 區(qū)編碼GP33 和GP72 蛋白。Alvarez-laionchere 等[10]以pIDKE2 為模板擴增655 bp 的core-E1 基因，插入pFP67xgpt 得pFP67-core-E1，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化雞胚成纖維細胞（CEF），免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。經(jīng)腹腔注射途徑將2×107PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后3周加強1 次，第一次接種后5 周顯示脾IFN-γ+斑點形成細胞（SFCs）數(shù)目增多，此時采用腹腔注射方法用106PFU 重組牛痘病毒（VV-core-E1）進行攻擊，攻擊后5 d 取卵巢檢查病毒負荷，結(jié)果表明免疫組的病毒負荷下降至1/100 左右。接著經(jīng)肌肉注射途徑將108PFU 疫苗接種非洲綠猴，第一次接種后12 和16 周加強2 次，第一次接種后18周提示血清外周血單核細胞（PBMC）數(shù)目明顯增多，此時經(jīng)皮下注射用107PFU 重組牛痘病毒（VV-core-E1）進行攻擊，攻擊后5 d 取血測定病毒負荷，結(jié)果提示免疫組血清的病毒負荷為0，而對照組血清的病毒負荷105PFU/mL。

1.2 牛病毒性腹瀉病毒

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是牛病毒性腹瀉的病原體之一。糖蛋白E2（GP53）是一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[11]。Elahi 等[12]將pCD-GP53 與pFPV重組得pFPV-GP53，加FPV 的野生株常規(guī)轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的53 kD 的GP53 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。經(jīng)足墊注射途徑將4×107PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后3 和6 周加強2 次，結(jié)果顯示血清IgG 和中和抗體在第一次接種后6～12 周上升，第一次接種后12 周有明顯提升，第一次接種后15 周提示脾細胞可分泌高水平的IFN-γ。

2 重組雞痘病毒抗皰疹病毒

2.1 傳染性喉支氣管炎病毒

傳染性喉支氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）是傳染性喉支氣管炎的病原體。糖蛋白B（gB）是高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，是一種保護性抗原[13]。Chen 等[14]以ILTV 的GG 株總RNA 為模板擴增gB 基因，插入pSY538 得pSY538-gB，與pSY681 重組得pSY681-gB，將IL-18 基因插入得pSY681-gB-IL-18，加FPV 的017 株轉(zhuǎn)化CEF，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。經(jīng)翅下刺種途徑將1×106PFU 疫苗接種1 d 齡仔雞，接種后6 周血清IgG 上升，PBMC 數(shù)目增多，流式細胞儀（FACS）檢測表明CD4+T 細胞增多，此時經(jīng)咽內(nèi)注射方法用100 EID50傳染性喉支氣管炎病毒GG 株攻擊，攻擊后2 周免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）和20%（2/10）。Tong 等[13]經(jīng)翅下刺種途徑將5×106PFU 的rFPV-gB/ILTV 疫苗接種42 d 齡的仔雞，結(jié)果提示血清IgG 在接種后2～6 周上升，接種后6 周有明顯提升；接種后6 周經(jīng)滴鼻方法用5.6M EID50傳染性喉支氣管炎病毒W(wǎng)G 株攻擊，攻擊后7 d 免疫組和對照組的存活率分別為100%（5/5）和0（0/5）。

2.2 馬立克病病毒

馬立克病病毒（Marek′s disease virus，MDV）又稱禽麻痹病毒，是馬立克病的病原體，該病是常見的雞淋巴增生性疾病，致死率較高。糖蛋白B（gB）是100 kD 的前體蛋白，可裂解為60 和49kD 的糖蛋白。PP38 是38 kD 的磷酸化蛋白，gB和PP38 蛋白均具有較好的免疫原性[16-17]。Yanagida 等[18]以pHA25 和pDC-gBdB13 為模板擴增PP38和gB 基因，分別插入pNZ1729R 得pNZ-PP38/gB，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的38/41 kD 的PP38 和100/60/49 kD 的gB 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。Nazerian 等[19-20]經(jīng)肌肉注射途徑將1×106PFU 疫苗接種1 d 齡仔雞，接種后2 周經(jīng)肌肉注射途徑用103PFU 馬立克病病毒RB1B 株攻擊，攻擊后2 周取血檢查病毒負荷，結(jié)果表明rFPV-gB、rFPV-PP38 組和對照組的保護力分別為90%（9/10）、30%（3/10）和10%（1/10）。接著經(jīng)翅下刺種途徑將106PFU 的rFPV-gB1 疫苗接種1 d 齡仔雞，接種后6 d 經(jīng)腹腔注射用500 PFU 馬立克病病毒MD5 株攻擊，攻擊后56 d 取血檢查病毒負荷，結(jié)果提示免疫組和對照組的保護力分別為23%（4/17）和0（0/17）。

丁巧玲等[21]以pUR-MDVEgB 為模板擴增gB基因，插入pEFgpt12s 得pEF-gB，加FPV 的282E4株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出2.8 kb 基因。彭大新等[22-23]將pMGB 與pFCS11 重組得pFCS11-gB，與pE/L-IFN 重組得pFCS11-gB-IFN-γ，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。采用皮下注射途徑將1×106PFU 疫苗接種萊杭雞，接種后8 d 經(jīng)腹腔注射用500 PFU 馬立克病病毒MD5 株攻擊，攻擊后30 d檢查發(fā)病情況，結(jié)果提示免疫組和對照組的保護力分別為75%（18/24）和16.7%（4/24）。

3 重組雞痘病毒抗副黏病毒

3.1 新城疫病毒

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是禽類新城疫的病原體，血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的活性，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，具有良好的免疫原性[24-25]。Boursnell等[26]以新城疫病毒BC 株的總RNA 為模板擴增HN 基因，插入pUC19 得pUC19-HN，與pB3ME 重組得pB3ME-HN，加入FPV 的野生株轉(zhuǎn)化DF1 細胞株，篩選重組病毒，Western 印跡提示重組病毒表達的66 kD 的HN 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用靜脈注射途徑將106、104和102PFU 重組病毒分別接種3 周齡仔雞，接種后3 周經(jīng)肌肉注射途徑用105ELD50新城疫病毒的有毒株攻擊，攻擊后16 d，106、104、102PFU 免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）、60%（6/10）、30%（3/10）和0（0/10）。

3.2 火雞鼻支氣管炎肺病毒

火雞鼻支氣管炎肺病毒（Turkey rhinotracheitis pneumovirus，TRTV）是火雞鼻支氣管炎的常見病原體，該病的病亡率高達90%。融合糖蛋白F可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[27]。Yu 等[28]以TRTV 總RNA 為模板擴增F 基因，插入pKS（+）得pKS-F，與pEFL29 重組得pEFL29-F，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的59 kD的F 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用翅下刺種途徑將1×105PFU 疫苗接種3 周齡火雞，第一次接種后2 周加強1 次，血清IgG 在第一次接種后1～4 周上升，第一次接種后4 周有明顯提升，在第一次接種后6 周經(jīng)點眼滴鼻方法用2×105MCD50火雞鼻支氣管炎肺病毒攻擊，攻擊后7 d 取鼻拭子檢查病毒負荷，結(jié)果提示免疫組的病毒負荷下降至1/1000 左右。

4 重組雞痘病毒抗RNA病毒

4.1 口蹄疫病毒

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）是家畜口蹄疫的病原體。FMDV 的3C 蛋白酶將前體蛋白P1-2A 裂解為VP0、VP1 和VP3，組裝為病毒樣顆粒（VLP），可誘導(dǎo)保護性的免疫應(yīng)答[29-30]。金寧一[31]將pKS-3C 與pUTA2 重組得pUTA-3C，將pGEM-P1-2A 與pUTA-3C 重組得pUTA-P1-2A-3C，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的79 kD 的P1-2A-3C 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。經(jīng)肌肉注射途徑將1×107PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后10 和20 d 加強2 次，第一次接種后30 d 血清IgG 上升，脾細胞的CTL 活性明顯增加，F(xiàn)ACS檢測表明脾CD4+和CD8+T 細胞顯著增多。Zhang等[32]采用肌肉注射途徑將5×107PFU 疫苗接種豚鼠，第一次接種后10 和20 d 加強2 次，第一次接種后40 d 血清IgG 和中和抗體上升，脾細胞增殖明顯，脾細胞的CTL 活性顯著增加，此時采用皮下注射方法用250 ID50口蹄疫病毒O1NYO 株進行攻擊，攻擊后1 周檢查足墊損傷情況，免疫組和對照組的保護力分別為75%（3/4）和0（0/4）。

將細胞因子的基因與病原體的抗原編碼基因共同插入同一載體可提高核酸疫苗的免疫應(yīng)答[33]。Ma 等[34]將pMD18-P12A-IL-18 與pUTAL-3C 重組得pUTA-3C-P12A-IL-18，加FPV 的282E4株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的80 kD 的P1 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用肌肉注射途徑將1×107PFU 疫苗接種仔豬，第一次接種后21 d 加強1 次，第一次接種后28 d PBMC 中IFN-γ+SFCs 顯著增多，血清IgG 和中和抗體上升，第一次接種后31 d 經(jīng)皮下注射用103ID50口蹄疫病毒O 株攻擊，攻擊后14 d 檢測足墊皮損情況，免疫組和對照組的保護力分別為80%（4/5）和0（0/5）。

豬園環(huán)病毒Ⅱ型的ORF2 編碼的衣殼蛋白（Cap）可刺激宿主產(chǎn)生中和抗體[35]。秦曉冰等[36-37]將pKS-P1 與pUTA2 重組得pUTA-P1，與pMDORF2 重組得pUTA-P1-ORF2，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出700 bp 的豬圓環(huán)病毒ORF2 基因和610 bp 的口蹄疫病毒VP1 基因，Western 印跡提示重組病毒表達的80 kD 的Cap-VP1 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用肌肉注射途徑將1×107PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后20 和40 d 加強2 次，第一次接種后50 d 血清IgG 上升，脾CD4+和CD8+T 細胞顯著增多。

4.2 豬瘟病毒

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的囊膜蛋白E0 是病毒吸附進入宿主細胞的主要蛋白，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[38]。王養(yǎng)會等[39]以pMD18-E0 為模板擴增E0 基因，插入pSY 得pSY-E0，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提基因組DNA 作為模板，用PCR 方法可克隆出0.7 kb 的E0 基因。首先，他采用肌肉注射途徑將1×106PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后1 和2 周加強2 次，血清IgG 在第一次接種后1～4周上升，第一次接種后4 周有明顯提升，滴度為1:4096。其次，他經(jīng)肌肉注射途徑將1×108PFU 疫苗接種2 月齡仔豬，第一次接種后1 和2 周加強2次，第一次接種后4 周經(jīng)肌肉注射用1×108PFU的CSFV 石門株攻擊，攻擊后10 d 計數(shù)發(fā)病例數(shù)，免疫組和對照組的保護力分別為75%（6/8）和0（0/6）。

4.3 傳染性法氏囊病病毒

傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）的VP2 蛋白可誘導(dǎo)小雞產(chǎn)生中和抗體[40]。Bayliss 等[41]將VP2 基因插入pBR322 得pBR322-VP2，與pEFL18 重組得pEFL18-VP2，再與pFPV9 重組得pFPV-VP2，加FPV 的FP9 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡提示重組病毒表達的172 kD 的VP2 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用翅下刺種途徑將1×107PFU 疫苗接種7 d 齡仔雞，第一次接種后2 周加強1 次，第一次接種后4 周經(jīng)滴鼻用1×108PFU 傳染性法氏囊病病毒52/70 株攻擊，攻擊后3 周免疫組和對照組的存活率分別為100%（23/23）和24%（4/17）。

Heine 等[42]以IBDV 基因組的DNA 為模板擴增VP2 基因，插入pAF09 得pAF09-VP2，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。采用翅下刺種途徑將2.5×106PFU 疫苗接種4 周齡仔雞，接種后3 周血清IgG 上升，此時經(jīng)點眼用100 CID50傳染性法氏囊病病毒002-73 株攻擊，攻擊后2 周免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。Butter 等[43]采用翅下刺種途徑將107PFU 疫苗接種7 d 齡仔雞，第一次接種后2 周加強1 次，血清IgG 和IgM于第一次接種后7～18 d 上升，分別于第一次接種后18 和7 d 有明顯提升，第一次接種后25 d 經(jīng)滴鼻途徑用10 EID50傳染性法氏囊病病毒F52/70 株攻擊，攻擊后5 d 免疫組和對照組的保護力分別為78%（23/30）和0（0/30）。

5 重組雞痘病毒抗逆轉(zhuǎn)錄病毒

5.1 Ⅰ型人類免疫缺陷病毒

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的env 基因編碼前體蛋白gp160，gp160 可裂解為gp120 和gp41。gp120 既可與中和抗體和CTL 結(jié)合，又可介導(dǎo)HIV 和易感細胞表面受體的結(jié)合。金寧一等[44]以pJenvl-10為模板擴增env 基因，插入pUTA-2 得pUTA-env，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)染CEF 細胞，用40 mg/mL的5-溴-2-脫氧尿苷（BudR）篩選重組病毒，Western 印跡提示重組病毒表達的120 kD 的gp120 蛋白可被患者的血清所結(jié)合，但未報道保護力試驗結(jié)果

5.2 猴免疫缺陷病毒

猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）與HIV 的核苷酸序列類似，對CD4+T 細胞和巨噬細胞均具有親嗜性。朱羿龍等[45]以pVR-SIVenv 為模板擴增2160 bp 的env 基因，插入pTKET 得pTKET-env，加FPV 的282E4 轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的120 kD 的gp120 蛋白可被患者的血清所結(jié)合，但未進行保護力試驗。

6 重組雞痘病毒抗其他病毒

6.1 禽流感病毒

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是病毒表面的主要蛋白，其中HA 可吸附于宿主細胞表面的唾液酸受體，促進病毒感染細胞；NA 裂解細胞表面的神經(jīng)氨酸酶殘基，在禽流感病毒的擴散、病毒粒子的釋放及防止病毒聚集等方面起作用。將HA和NA 的核酸疫苗免疫宿主可誘導(dǎo)中和性抗體的產(chǎn)生[46]。程素娟等[47]以禽流感病毒的總RNA 為模板擴增HA 和NA 基因，插入pGEM-T 得pGEMHA/NA，將pGEM-HA 與p11S 重組得p11S-HA，將pGEM-NA 與pSKCFN 重組得pSK-NA，將pSK-NA與p11S-HA 重組得p11S-HA-NA，加FPV 的282E4株轉(zhuǎn)化CEF，篩選重組病毒，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。經(jīng)皮下注射途徑將105PFU 疫苗接種7 d 齡仔雞，接種后21 d 經(jīng)肌肉注射途徑用105ELD50禽流感病毒H5N5 株攻擊，攻擊后7 d 免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

6.2 人乳頭瘤病毒16 型

人乳頭瘤病毒16 型（Human papillomavirus type 16，HPV-16）的E6/E7 蛋白具有較好的免疫原性。Pozzi 等[48]以pSP65 為模板擴增E6/E7 基因，插入pFP128 得pFP128-E6/E7，加FPV 減毒株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RTPCR 方法可克隆出477 bp 的E6 和297 bp 的E7基因。Radaelli 等[49]將1.8×107宮頸癌細胞VX2T 皮下注射新西蘭大白兔，同時皮下注射1.8×108PFU重組病毒進行免疫治療，第一次免疫治療后1、2、3、4 和5 個月加強5 次，末次治療后24 d 顯示腫瘤消退。Radaelli 等[50]以pCD-E7GGG 為模板擴增298 bp 的E7GGG 基因，插入pFP-MCS-GFP 得pFP-E7GGG，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的18 kD 的E7GGG蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用皮下注射途徑將5×103宮頸癌TC-1 細胞注射C57BL/6 鼠，注射后3 d 經(jīng)肌肉注射途徑用100 μg pCD-E7GGG進行免疫治療，第一次免疫治療后10 d 皮下注射107PFU 重組FPV-E7GGG 疫苗進行第2 次治療，第一次治療后23 d 免疫組和對照組的腫瘤檢出率分別為16.7%（1/6）和40%（2/5），第一次治療后45 d 免疫組和對照組的腫瘤檢出率分別為50%（3/6）和83.3%（5/6）。Zanotto 等[51-52]以pUF31L1 為模板擴增530 bp 的L1 基因，插入pCR-Ⅱ得pCRⅡ-L1，與pFRMCS-GFP 重組得pFP-L1，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的55 kD 的L1 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用皮下注射途徑將1×107PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后2 周加強1 次，血清IgG在接種后15～24 d 上升，第一次接種后24 d 有明顯提升，但血清的中和抗體升高不顯著。

6.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的ORF5 和ORF3 基因分別編碼GP5 和GP3 蛋白，GP5 誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，GP3 誘導(dǎo)細胞免疫，且和GP5 具有協(xié)同免疫作用。ORF6 基因編碼的膜基質(zhì)蛋白（M）保守性較高，ORF7 基因編碼的核衣殼蛋白（N）誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體的時間較早，且持續(xù)時間長。將它們的重組蛋白或DNA 疫苗免疫豬或小鼠均可有效對抗PRRSV 的攻擊[53-56]。沈國順等[57-58]以pMD18-ORF5/ORF3 為模板擴增444 bp 的ORF5 和339 bp 的ORF3 基因，插入pKS（-）得pKS-ORF5/ORF3，將ORF3 基因插入pKSORF5 得pKS-ORF5-ORF3，與pUTAL-IL-18 重組得pUTAL-IL-18-ORF5-ORF3，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的51.8 kD 的融合蛋白和18 kD 的IL-18 可被患者的血清所結(jié)合。采用肌肉注射途徑將1×107PFU疫苗接種3 周齡仔雞，第一次接種后3 周加強1次，第一次接種后8 周血清IgG 和中和抗體上升，PBMC 顯著增殖，F(xiàn)ACS 檢測證實PMBC 中CD4+和CD8+T 細胞增多，ELISPOT 表明PBMC 中IFN-γ+SFCs 增多。第一次接種后60 d 經(jīng)滴鼻方法用105TCID50豬繁殖與呼吸綜合征病毒長春株攻擊，攻擊后7 d 取肺組織檢查病毒負荷，免疫組肺組織的病毒負荷下降至1/10 左右。

智海東等[59]以PRRSV 的DNA 為模板擴增380 bp 的N 基因，插入pSY538 得pSY538-N，與pSY681 重組得pSY681-N，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，用40 mg/mL BudR 篩選重組病毒，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。韓松等[60]將pBSK-ORF5-ORF6 與pUTA2 重組得pUTA2-ORF5-ORF6，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出410 bp 的ORF5 和353 bp 的ORF6 基因。采用肌肉注射途徑將1×108PFU 疫苗接種BALB/c鼠，第一次接種后2 和4 周加強2 次，第一次接種后6 周血清IgG 上升，脾細胞顯著增殖，可分泌高水平的IFN-γ，但不分泌IL-4 和IL-10 等。

6.4 傳染性支氣管炎病毒

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的棘突蛋白1（S1）是一種保護性免疫原[61]。管倩等[62]以pGEM-S1 為模板擴增S1 基因，插入pSY538 得pSY538-S1，與pSY681 重組得pSY681-S1，將IL-18 基因插入得pSY681-S1-IL-18，加FPV 的017 株轉(zhuǎn)化CEF；從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出1.74 kb的S1 基因和0.6 kb 的IL-18 基因。Chen 等[63]采用翅下刺種途徑將106PFU 重組病毒接種7 d 齡萊杭仔雞，接種后6 周血清IgG 上升，F(xiàn)ACS 檢測表明PBMC 中CD4+和CD8+T 細胞增加，此時經(jīng)點眼滴鼻途徑用100 EID50傳染性支氣管炎病毒HN99 株攻擊，攻擊后10 d 取腎組織檢查病毒負荷，免疫組和對照組的保護力分別為100%（20/20）和0（0/20）。Shi 等[64]采用類似方法構(gòu)建了rFPV-S1-IFN-γ，經(jīng)翅下刺種途徑將103PFU 疫苗接種4 周齡仔雞，接種后3 周血清IgG 上升，F(xiàn)ACS 檢測顯示PBMC 中CD4+T 細胞增加，此時經(jīng)滴鼻用104EID50傳染性支氣管炎病毒LX4 株攻擊，攻擊后6 d 取咽拭子檢查病毒負荷，免疫組和對照組的保護力分別為60%（3/5）和0（0/5）。

6.5 牛痘病毒

牛痘病毒（Vaccinia virus，VV）的LI、A27、A33和B5 蛋白是4 種主要的病毒粒子蛋白，主要參與病毒的吸附、融合和穿鉆靶細胞，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較好的保護力[65]。Pacchioni 等[66]以牛痘病毒RR株的總RNA 為模板分別擴增L1R、A27L、A33R 和B5R 基因，插入pBS Ⅱ得pBS-L1R/A27L/A33R/B5R，與pFPmcs 重組得pFP-L1R/A27L/A33R/B5R，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的27 kD 的L1R、12.7 kD 的A27L、21 kD 的A33R 和37 kD 的B5R 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。

6.6 出血性腸炎病毒

出血性腸炎病毒（Hemorrhagic enteritis virus，HEV）是火雞出血性腸炎的常見病原體。六鄰體蛋白（hexon）是殼蛋白的主要結(jié)構(gòu)成分，是有效的免疫原[67]。Cardona 等[68-69]以HEV 基因組DNA 為模板擴增hexon 基因，插入pFPV 得pFPV-hexon，加FPV 的野生株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的100 kD 的hexon 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用翅下接種途徑將105PFU 疫苗接種1 d 齡仔雞，接種后4 周血清IgG 上升，接種后6 周口服106TCID50出血性腸炎病毒有毒株進行攻擊，攻擊后6 d 免疫組和對照組的保護力分別為100%（7/7）和0（0/7）。

6.7 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus，RV）的狂犬病毒糖蛋白（RGP）具有較強的免疫原性[70]。金寧一等[71-72]將pSK-RVG 與pUTA2 重組得pUTA2-RVG，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的67 kD 的蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用皮下注射途徑將1×107PFU 疫苗接種昆明鼠，第一次接種后2 周經(jīng)肌肉注射用100 μg的pVAX-RVG 加強，第一次接種后4 周血清IgG上升，脾CD4+和CD8+T 細胞明顯增加，此時經(jīng)肌肉注射途徑用10M LD50狂犬病毒CVS 株攻擊，攻擊后43 d 免疫組和對照組的保護力分別為42%（3/7）和0（3/7）。

6.8 豬園環(huán)病毒Ⅱ型

豬園環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2，PCV2）的基因組有2 個ORF，其中ORF1 編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep），ORF2 編碼衣殼蛋白（Cap），自身可聚合為病毒樣顆粒。Rep 和Cap 可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生中和抗體[73]。韓松等[74]將pMD18-ORF2/PCV 與pUTA2 重組得pUTA2-ORF2，加FPV 的282E4 株共同轉(zhuǎn)化CEF，從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出260 bp 的ORF2 基因。郭曉慶等[75]以PCV2 的DNA 為模板擴增ORF2基因，插入pSY681 得pSY681-ORF2，將IL-18 基因插入得pSY681-ORF2-IL-18，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，從重組病毒中抽提總RNA 作為模板，用RT-PCR 方法可克隆出702 bp 的ORF2 和579 bp 的IL-18 基因。

6.9 番鴨細小病毒

番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）是番鴨細小病毒病的病原體，主要引起急性敗血性傳染病，致死率高。VP3 蛋白是一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的免疫原性[76]。李林林等[77]將pMD-VP3 與pTKS 重組得pTKS-VP3，與pCDEGFP 重組得pTKS-VP3-EGFP，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，從重組病毒中抽提基因組DNA 作為模板，用PCR 方法可克隆出1.6 kb 的VP3 基因，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。

7 重組雞痘病毒抗細菌

7.1 禽艾美球蟲

禽艾美球蟲（Eimeria tenella）是雞球蟲病的病原體，主要引起腸道病變。Rhomboid 基因編碼蛋白在表皮生長因子受體的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[78]。楊桂連等[79-80]以禽艾美球蟲卵囊的總RNA為模板擴增774 bp 的Rhomboid 基因，插入pMD18-T 得pMD18-Rhomboid，與pUYA2 重組得pUTA2-Rhomboid，加FPV 的282E4 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的28 kD 的蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用皮下注射途徑將102、103和104PFU 疫苗分別接種7 d 齡仔雞，第一次接種后7 d 加強1 次，第一次接種后14 d PBMC 中CD4+和CD8+T 細胞增加，此時經(jīng)口服途徑用5×104禽艾美球蟲的卵囊攻擊，攻擊后7 d 計數(shù)糞便卵囊，發(fā)現(xiàn)102、103和104PFU 疫苗免疫組的減囊率分別為67.5% 、71.1% 和71.2%。接著采用翅下刺種途徑將102、104和106PFU 疫苗接種1 d 齡仔雞，接種后2 周血清IgG 上升，PBMC 顯著增殖，此時經(jīng)腹腔注射途徑用5×104禽艾美球蟲卵囊攻擊，攻擊后8 d 計數(shù)糞便卵囊，各組的減囊率分別為39.6%、41.1%和41.7%。

7.2 雞敗血支原體

雞敗血支原體（Mycoplasma gallisepticum）引起的雞支原體病主要以慢性呼吸道感染為特征[81]。Zhang 等[81]采用翅下刺種途徑將106PFU 的rFPV-mgc 疫苗接種8 周齡仔雞，接種后2 周經(jīng)皮下注射途徑用103EID50有毒株攻擊，攻擊后2 周計數(shù)發(fā)病情況，免疫組和對照組的保護力分別為90%（9/10）和0（0/10）。

8 重組雞痘病毒抗寄生蟲

8.1 惡性瘧原蟲

惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）的肝期抗原3（LSA-3）、子孢子蘇氨酸和天冬酰胺富集蛋白（STARP）、外排蛋白1（Exp1）、Pfs16、血小板相關(guān)黏附蛋白（TRAP）和肝期抗原1（LSA-1）均是較好的瘧疾疫苗的候選抗原，將它們加各種佐劑免疫夜猴、猩猩或健康志愿者均可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，并可對抗惡性瘧原蟲子孢子的攻擊感染[83-85]。L3SEPTL 基因含這6 種抗原的細胞表位，Prieur 等[86]人工合成L3SEPTL 基因，將其插入pFP-GFP 得pFP-L3SEPTL，加FPV 的FP9 株轉(zhuǎn)化CEF，免疫熒光提示重組病毒可以呈現(xiàn)融合蛋白分子。采用靜脈注射途徑將106PFU 疫苗接種C57BL/6 鼠，第一次接種后2 周加強1 次，第一次接種后4 周PBMC 的IFN-γ+SFCs 增加，脾細胞增殖，脾細胞CTL 反應(yīng)性增強。

8.2 伯氏瘧原蟲

伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei，Pb）的環(huán)子孢子蛋白（CSP）在子孢子入侵肝細胞時起重要作用，將PbCSP 合成肽加P1005 佐劑皮下接種A/J 鼠可有效對抗Pb 子孢子的攻擊[87]。Anderson 等[88]將PbCSP 基因插入pEFL29 得pEFL29-PbCSP，加FPV的FP9 株轉(zhuǎn)化CEF，Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)重組病毒表達的44 kD 的PbCSP 蛋白可被患者的血清所結(jié)合。采用靜脈注射途徑將1×106PFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第一次接種后2 周靜脈注射1×106PFU 重組牛痘病毒（MVA-PbCSP）進行加強，第一次接種后4 周脾IFN-γ+SFCs 增加，F(xiàn)ACS 檢測顯示脾CD8+T 細胞增加，第一次接種后6 周經(jīng)靜脈注射途徑用500 個伯氏瘧原蟲Anka 株子孢子攻擊，攻擊后2 周取血鏡檢Pb，免疫組和對照組的保護力分別為67.5%（27/40）和0（0/10）。

9 結(jié)語

重組雞痘病毒具有下述優(yōu)點：雞痘病毒有嚴(yán)格的宿主特異性，只感染禽類，在哺乳動物的細胞內(nèi)只產(chǎn)生流產(chǎn)性感染；重組雞痘病毒不容易發(fā)生散毒現(xiàn)象，對人和其他哺乳動物無危險性；重組雞痘病毒能有效進入一些哺乳動物的細胞內(nèi)并進行早期基因、少量晚期基因的表達和病毒DNA 復(fù)制，但不能發(fā)育為成熟的病毒粒子，然而這種一過性感染并不影響外源基因的正確表達；重組雞痘病毒具有自身的酶系統(tǒng)和調(diào)控信號，其轉(zhuǎn)錄、翻譯和調(diào)控均在胞漿進行，避免了病毒基因組插入宿主細胞染色體的可能性；重組雞痘病毒表達的蛋白存在糖基化和磷酸化等加工修飾過程，與天然蛋白的差異不大；重組雞痘病毒可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答的持續(xù)時間長；重組雞痘病毒的病毒衣殼蛋白可直接激活核因子NF-κB，在短期即可激發(fā)有效的免疫應(yīng)答；重組雞痘病毒較穩(wěn)定，反復(fù)凍融并不引起病毒的改變和失活。

重組雞痘病毒存在下述不足：非復(fù)制型機理的研究尚不深入；表達載體缺乏高效啟動子或增強子，導(dǎo)致表達效率較低；載體抗原和靶抗原存在競爭；母源抗體的干擾可影響免疫效果。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們將對病毒、細菌或寄生蟲的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀遺傳學(xué)進行深入研究，從而弄清病原蛋白的抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，篩選新的抗原分子，構(gòu)建由各期抗原分子組成的多期多價疫苗。在重組雞痘病毒的構(gòu)建過程中，要深入了解各個啟動子的特性，弄清啟動子和起始密碼子的距離以及啟動子之間相互作用是否影響外源基因的表達效率；選用不同的啟動子構(gòu)建載體能否提高重組雞痘病毒的遺傳穩(wěn)定性；不同啟動子的反向串聯(lián)能否減少外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上的干擾，促進外源基因的表達；重組雞痘病毒共表達細胞因子的探索；重組雞痘病毒共表達多種病原蛋白的探索；新型佐劑和疫苗載體的研制等。相信隨著這些問題的闡明，必將推動重組雞痘病毒疫苗的研究躍上一個新的臺階。