腫瘤中細(xì)胞程序性死亡配體1糖基化及泛素化的調(diào)控

黎素?zé)?，林幼玉，王清?/p>

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350117

免疫檢查點(diǎn)通過調(diào)控T 細(xì)胞在一定范圍內(nèi)活化，進(jìn)而阻止過度的免疫反應(yīng)以及維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，因此，免疫檢查點(diǎn)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[1]。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDL1）是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)之一[2]。T細(xì)胞激活可以誘導(dǎo)PD-1 的表達(dá)，而PD-L1 在多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌及黑色素瘤中表達(dá)[3-4]。在腫瘤中，PD-L1 是PD-1的主要配體，腫瘤細(xì)胞利用自身表達(dá)的PD-L1 與活化的T 細(xì)胞上的受體PD-1 結(jié)合，來增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的數(shù)量或抑制其活性、下調(diào)T 細(xì)胞的活性、增強(qiáng)T 細(xì)胞的耐受性等途徑[2,4]，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。

研究表明，糖基化、泛素化能夠在翻譯后水平調(diào)控PD-L1 的表達(dá)[5]。表皮生長因子（EGF）對PD-L1 糖基化的調(diào)控及細(xì)胞周期蛋白D-CDK4 對PD-L1 泛素化的調(diào)控均能影響PD-L1 與PD-1 的結(jié)合，故EGF 或D-CDK4 與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用時(shí)，可以顯著提高T 細(xì)胞的抗腫瘤活性[6-7]。因此，調(diào)控PD-L1 的糖基化或泛素化可能是腫瘤免疫治療的潛在手段。在此，我們簡要綜述腫瘤中PD-L1 的糖基化及泛素化修飾的調(diào)控研究進(jìn)展。

1 PD-1/PD-L1

PD-1 是由288 個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞外部分含有一個免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，胞質(zhì)部分含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和一個免疫受體酪氨酸開關(guān)基序（ITSM）[4]，這2 個基序中的酪氨酸能夠被磷酸化Src 同源磷酸酶1（SHP-1）和2（SHP-2）結(jié)合并磷酸化。PD-1 最先是在凋亡的T 細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)的，能夠介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，主要表達(dá)于活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等[8-9]。PD-1 對于細(xì)胞耐受性的維持和免疫系統(tǒng)T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有重要意義[10]。PD-L1 和PD-L2 是PD-1 的2 個配體，但在腫瘤細(xì)胞中PD-1 主要的配體是PD-L1。

PD-L1 是由290 個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，含有跨膜結(jié)構(gòu)域、Ig-V 和Ig-C 樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及可能不包括信號基序但在不同物種中高度保守的短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[11-12]。通常，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常體細(xì)胞[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1 不僅存在于細(xì)胞內(nèi)及定位于細(xì)胞膜上，還可以以不同的形式被分泌并游離在腫瘤細(xì)胞外[14-15]。體外對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行PD-L1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)，腫瘤細(xì)胞利用PD-L1與T 細(xì)胞的PD-1 結(jié)合抑制免疫反應(yīng)，使得細(xì)胞毒性T 細(xì)胞不能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤在小鼠體內(nèi)的發(fā)生和侵襲正常組織的能力[16-18]。這提示了PD-L1 是腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子。

腫瘤微環(huán)境中PD-L1 和PD-1 的表達(dá)水平比正常組織中高。當(dāng)PD-L1 和PD-1 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，即會誘導(dǎo)T 細(xì)胞募集SHP-1 和SHP-2 對PD-1 細(xì)胞內(nèi)ITIM 和ITSM 基序中的酪氨酸進(jìn)行磷酸化，隨后抑制TCR 信號的傳導(dǎo)途徑，減少T細(xì)胞的活化[19-20]。PD-L1 和PD-1 結(jié)合也會通過抑制CD8+和Treg 等T 細(xì)胞的分化及激活，誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞溶解活性，并進(jìn)一步抑制抗腫瘤免疫[12,17,21]。

2 腫瘤細(xì)胞中PD-L1 糖基化的調(diào)控

2.1 糖基化

糖基化是發(fā)生在哺乳動物中的一種重要的翻譯后修飾，膜蛋白和分泌蛋白質(zhì)幾乎都需要經(jīng)過糖基化修飾[22]。糖基化對蛋白質(zhì)的折疊、定位、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫原性具有重要的作用[17,23]。糖基化主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，需要復(fù)雜的酶、細(xì)胞器以及成功產(chǎn)生碳水化合物相關(guān)翻譯后修飾所需的其他因子的協(xié)同作用[22]。N-糖基化和O-糖基化是哺乳動物細(xì)胞中最常見的糖基化修飾類型[24]。

糖基化異常是惡性腫瘤細(xì)胞的一個普遍特征。與正常組織相比，腫瘤細(xì)胞通常顯示出異常的糖基化修飾。糖基化異常與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及免疫逃逸等關(guān)系密切[25]。黏蛋白、CD147、骨橋蛋白、α2-巨球蛋白和CD44 等蛋白質(zhì)的異常糖基化修飾也被證實(shí)有助于腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲、增殖或免疫逃逸[24,26-29]。

2.2 PD-L1 糖基化的調(diào)控

N-糖基化在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用。N-糖基化是膜上蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要翻譯后修飾，例如配體和受體之間的相互作用。N-糖基化是PD-L1 糖基化修飾的主要形式，且PD-L1 糖基化對維持其本身的穩(wěn)定性至關(guān)重要[6,17]。目前，發(fā)現(xiàn)并確定的N-糖基化位點(diǎn)有N35、N192、N200 和N219，而且在這4 個位點(diǎn)上僅僅發(fā)生N-糖基化，其中N192、N200 和N219的N-糖基化有助于PD-L1 的穩(wěn)定[6]。

腫瘤細(xì)胞中PD-L1 糖基化修飾有多種調(diào)控機(jī)制。N-糖基轉(zhuǎn)移酶STT3 有2 種亞型，即STT3A和STT3B，二者協(xié)同維持腫瘤細(xì)胞PD-L1 糖基化的穩(wěn)定[30]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通過β連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)N-糖基轉(zhuǎn)移酶STT3，并且隨后STT3依賴的PD-L1 N-糖基化維持穩(wěn)定并上調(diào)PD-L1的表達(dá)，依托泊苷可逆轉(zhuǎn)這種情況[30]。Li 等描述了糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通過b-TrCP 誘導(dǎo)PD-L1 的磷酸化依賴性蛋白酶體降解，而這種相互作用被N192、N200 和N219 處的PD-L1 糖基化拮抗，因此，在乳腺癌中，EGF 誘導(dǎo)GSK3β的失活可誘導(dǎo)PD-L1 的糖基化增加，以此維持PD-L1 的穩(wěn)定表達(dá)[6]。β-1，3-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）是在高爾基體中表達(dá)的Ⅱ型跨膜蛋白，可在聚-N-乙?；樘前锋湹纳锖铣蛇^程中發(fā)揮作用，并且具有調(diào)節(jié)T 細(xì)胞歸巢、L-選擇素配體功能和淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)墓δ躘31]。Li 等的研究表明，由于PD-L1 的N192 和N200 上的聚糖結(jié)構(gòu)都含有聚-N-乙?；樘前?，EGF 可通過上調(diào)B3GNT3 來增強(qiáng)PD-L1 糖基化[32]。另外，2-脫氧葡萄糖被證明可以作為葡萄糖類似物來降低PD-L1糖基化[33]。Cha 等也在體內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)，PDL1 S195 磷酸化與PD-L1 4NQ 的情況一致，即S195 磷酸化后PD-L1 不能正常進(jìn)行糖基化修飾，此時(shí)PD-L1 的穩(wěn)定性下降[17]。

在腫瘤中，糖基化修飾不僅影響PD-L1 的穩(wěn)定，而且影響PD-L1 的功能和腫瘤免疫。Li 等對PD-L1 的4 個N-糖基化位點(diǎn)N35、N192、N200 和N219 進(jìn)行突變以及使用N-糖基化抑制劑處理野生型PD-L1，發(fā)現(xiàn)PD-L1 N-糖基化的改變顯著降低了PD-L1 和PD-1 的結(jié)合，使T 細(xì)胞活化增加以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，提示腫瘤免疫中的PD-1與PD-L1 相互作用需要PD-L1 的糖基化[32]。腫瘤細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理后，PD-L1 糖基化不能正常進(jìn)行，直接導(dǎo)致PD-1 與PD-L1 的結(jié)合顯著減少，且腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞群體數(shù)量及活化提高，體內(nèi)腫瘤的生長也被抑制[17]。2-脫氧葡萄糖及抑制EGF 降低PD-L1 的穩(wěn)定性，均能破壞PD-L1 與PD-1 之間的相互作用，使腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性重新恢復(fù)敏感，增強(qiáng)了T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的有效殺傷[32,33]。

3 腫瘤細(xì)胞中PD-L1 泛素化的調(diào)控

3.1 泛素化

泛素化調(diào)節(jié)多種復(fù)雜的細(xì)胞過程，包括蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體內(nèi)吞和DNA 損傷修復(fù)，是真核生物中常見的蛋白翻譯后修飾[34,35]。泛素化即是在泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2 及泛素連接酶E3 等一系列酶的參與下，將泛素添加到靶蛋白上[36]。細(xì)胞中不需要的或受損的蛋白質(zhì)在被蛋白酶體識別并降解之前，需要被泛素化。泛素化與乙?；土姿峄粯?，都是可逆反應(yīng)，其逆向反應(yīng)為去泛素化。

在癌癥中，泛素化可能導(dǎo)致致癌途徑的激活或失活。E3 連接酶和去泛素化酶可調(diào)節(jié)促癌或抑癌蛋白的活性或降解，如核因子κB（NF-κB）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（p27）和抑癌基因p53 的異常表達(dá)與癌癥相關(guān)[37]。靶向泛素化E3 連接酶的抗腫瘤藥物IMiDs 已獲得了美國FDA的批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床[38]。去泛素化酶的抑制劑WP1130、P5091 和B-AP15 已被證明可分別增強(qiáng)抗腫瘤活性、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[39]。

3.2 PD-L1 的泛素化調(diào)控

PD-L1 的泛素化位點(diǎn)尚不清楚，但UbPred 預(yù)測軟件指出PD-L1 中的2 個賴氨酸殘基（K178，K281）很大可能是潛在的泛素化位點(diǎn)[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解的E3 連接酶HRD1 也可作為腫瘤細(xì)胞中PD-L1 泛素化的E3 連接酶[17]。目前對于PD-L1 泛素化的位點(diǎn)及參與泛素化過程的特異性酶的了解比較少，人們的關(guān)注點(diǎn)主要集中在腫瘤細(xì)胞中PD-L1 泛素化的調(diào)控機(jī)制。

細(xì)胞周期蛋白D-CDK4 是一種翻譯后調(diào)控的負(fù)調(diào)控因子，可以影響PD-L1 的泛素化。DCDK4 通過誘導(dǎo)滯蛋白3（cullin 3）-SPOP 介導(dǎo)的PD-L1 泛素化來負(fù)調(diào)控PD-L1 的表達(dá)，并且CDK4/6 的抑制提高了PD-L1 表達(dá)水平，這一泛素化調(diào)控與抗PD-1/PD-L1 療法協(xié)同可增強(qiáng)腫瘤免疫[7,40]。此外，COP9 信號復(fù)合體5（CSN5）作為一種致癌蛋白，具備去泛素化的活性，也是一種PD-L1 泛素化的負(fù)調(diào)控因子[41-43]。CSN5 的表達(dá)受腫瘤壞死因子α（TNF-α）的誘導(dǎo)，使PD-L1 去泛素化以穩(wěn)定PD-L1，CSN5 抑制劑姜黃素可逆轉(zhuǎn)這種情況，并提高CTLA4 阻斷療法的治療效果[43]。CKLF 樣MARVEL 跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白6（CMTM6）是一種普遍表達(dá)的蛋白質(zhì)，可調(diào)控跨膜蛋白和分泌蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。CMTM6 可結(jié)合PD-L1，并有助于PD-L1 在細(xì)胞周期中減少泛素化和溶酶體降解，誘導(dǎo)并穩(wěn)定PD-L1 在細(xì)胞膜上的表達(dá)，增強(qiáng)表達(dá)PD-L1 的腫瘤細(xì)胞抑制T 細(xì)胞的能力[44]。

PD-L1 的糖基化異常，亦能使PD-L1 的泛素化增加。Li 等將PD-L1 的4 個糖基化位點(diǎn)N35、N192、N200 和N219 同時(shí)突變或使用衣霉素處理，使PD-L1 處于非糖基化狀態(tài)，在蛋白酶體抑制劑MG132 存在下檢測到非糖基化PD-L1 的泛素化明顯增加[6]。此外，還發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，GSK3β可以通過β-TrCP 介導(dǎo)PD-L1 泛素化而使其被蛋白酶體降解，EGF 可以使GSK3β失活增加PD-L1的糖基化來減少PD-L1 的泛素化[6]。隨后，Horita等也再次證明EGF 確實(shí)具有抑制PD-L1 的泛素化的作用[5]。二甲雙胍誘導(dǎo)PD-L1 磷酸化，導(dǎo)致PD-L1 糖基化異常而使PD-L1 泛素化增加，進(jìn)而誘導(dǎo)蛋白酶體降解，并在腫瘤微環(huán)境中增加CD8+T 細(xì)胞的活化及對腫瘤細(xì)胞的殺傷，協(xié)同CTLA4 抗體顯著抑制腫瘤的生長[17]。

4 結(jié)語

腫瘤中的糖基化和泛素化異常影響腫瘤細(xì)胞的功能性，如增殖、侵襲、凋亡及腫瘤免疫等，調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白的糖基化或泛素化很大可能會影響腫瘤的發(fā)展或刺激免疫系統(tǒng)對腫瘤進(jìn)行攻擊，是潛在的治療腫瘤的方法。此外，糖基化和泛素化被證明能通過影響腫瘤細(xì)胞的PD-L1的穩(wěn)定和功能性而影響PD-L1 與T 細(xì)胞的PD-1的結(jié)合，從而進(jìn)一步影響腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。目前，在臨床上已有5 種抗體針對PD-1/PD-L1 這一免疫靶點(diǎn)治療癌癥，但抗體治療并不能在每個腫瘤患者中都取得很好的療效。因此，通過調(diào)控PD-L1 的糖基化和泛素化，進(jìn)而破壞PD-L1 與PD-1 之間的相互作用，同時(shí)協(xié)同臨床上的抗腫瘤治療藥物對腫瘤患者進(jìn)行免疫治療，可能是潛在的免疫治療手段。