辣根過氧化物酶-金屬有機骨架納米纖維復合物生物傳感器的制備及其用于食品中過氧化氫殘留檢測的研究

,,,+,*

(1.寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315211; 2.上海大學生命科學學院,上海 200444; 3.中科院寧波材料技術與工程研究所,浙江寧波 315201)

近年來,食品安全問題越來越受到人們的關注。過氧化氫作為抗菌劑、氧化還原劑以及漂白劑等被廣泛應用于臨床治療、生物和食品加工等各個領域[1]。在國內,過氧化氫作為食品加工助劑,在食品加工過程中被廣泛使用。美國食品藥品監(jiān)督管理局將過氧化氫列為“一般公認安全添加劑”,但最大添加量有明確規(guī)定,且在食品加工生產中,過氧化氫殘留需要通過適當的物理或化學方法去除[2]。由于過氧化氫應用廣泛,監(jiān)查難度大,如不規(guī)范使用,會導致食品中過氧化氫超標。過氧化氫進入人體后不僅會損壞人體細胞,最終加速人體衰老甚至誘發(fā)心血管疾病,對人體中樞神經造成不可逆損害,誘發(fā)像阿爾茲海默癥、癌癥等一系列老化相關疾病，最終對人體健康帶來危害[3-4]。因此急需開發(fā)一種快速高效檢測過氧化氫的方法。

目前,雖然檢測過氧化氫有許多方法,如傳統(tǒng)的滴定法[5]、熒光分光光度法[6]、紫外分光光度法[7]、紙片法[8-9]以及色譜法等[10],但是傳統(tǒng)的方法相對于生物傳感器來說靈敏度不夠高,需要昂貴的儀器,復雜的操作,專業(yè)的操作人員,嚴格的實驗環(huán)境,以及無法實現現場快速檢測等。生物傳感器尤其是酶電化學傳感器具有高選擇性、高靈敏度、易小型化的特點,可以實現原位實時檢測從而獲得了更多關注。生物傳感器的商業(yè)進程一直備受限制,其主要原因是以酶為活性識別單元的傳感器容易受環(huán)境影響導致其活性及穩(wěn)定性降低。因此,發(fā)展新的固定化平臺來提升酶對環(huán)境的穩(wěn)定性是實現酶傳感器商業(yè)化的重要研究內容[11]。

辣根過氧化物酶是一種含有鐵卟啉輔基的糖蛋白復合酶,是當前研究最廣泛的一種過氧化物酶。在過氧化氫存在的情況下,辣根過氧化物酶能夠催化氧化多種化合物,特別是含有大(共軛體系的物質,如酚類、芳香類、苯胺類、吲哚等化合物[12]。金屬骨架材料(MOFs)是有機-無機雜化多孔材料,是一類由變價金屬、p區(qū)金屬元素、堿土金屬、錒系元素等金屬離子,與可調控的有機鏈像羧酸類、胺類、硝酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽類等,配位而成[13-15]。MOFs具有超高的孔隙率,最大可以達到6000 m2/g的比表面積,可以調節(jié)的形態(tài)以及孔徑大小,多樣的功能化可修飾性,非常適合用于酶的固定化[16-18]。MOFs固定化酶研制電化學傳感器對于酶電化學傳感器性能發(fā)展提供了一個新的方向,故本研究合成了一種高穩(wěn)定性的金屬骨架納米纖維(MONFs),通過物理吸附將辣根過氧化物酶固定化于金屬骨架納米纖維,并利用殼聚糖凝膠作為成膜劑,構筑了辣根過氧化酶-金屬骨架納米纖維傳感器并用于過氧化氫的檢測。檢測過程中使用的對苯二酚具有電化學可逆性、穩(wěn)定性及快速的電子傳導能力,同時較低的氧化還原電位也有利于電化學檢測,是一種非常優(yōu)良的電子傳遞體[19]。利用對苯二酚作為電子傳遞體,采用循環(huán)伏安法研究所構筑酶傳感器的電化學特性和穩(wěn)定性,采用電流-時間法研究了酶傳感器的選擇性、線性關系及檢測范圍,本研究為食品中過氧化氫的殘留檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣根過氧化物酶(HRP,活性大于250 U mg-1) 美國Sigma公司;過氧化氫溶液、對苯二酚、殼聚糖(Chit,脫乙酰化95%)、氯化鉀、天冬氨酸、乙酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;六水硫酸銅、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司;0.1mol/L的磷酸緩沖溶液(PBS,pH7.5)由磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀配制被用作電解液,所有的水溶液由新鮮的超純水(18 MΩ·cm)制備;雞爪 當地農貿市場;牛奶盒裝 250 mL,伊利純牛奶,當地超市;所有化學藥品 均為分析純。

D8 Discover XRD粉末X射線衍射儀(XRD) 德國布魯克公司;S-4800掃描電子顯微鏡(SEM) 日本日立公司;TG16-WS臺式離心機 上海盧湘儀離心機公司;MITR-YXQM-0.4L行星式球磨機 長沙米淇儀器設備有限公司;XSE105分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BCD102小冰箱 深圳先科電器有限公司;800Y高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司;采用上海辰華CHI760E電化學工作站三電極體系進行電化學測試,工作電極和輔助電極分別為玻碳電極和鉑絲電極,飽和甘汞電極(SCE)作參比電極。

1.2 實驗方法

1.2.1 金屬骨架納米纖維的合成與表征 在室溫下,將6 mL六水硫酸銅水溶液(4.5 mmol/L)加到30 mL含有氫氧化鈉(6 mmol/L)與天冬氨酸(3 mmol/L)的混合溶液中,溶液迅速變?yōu)樗{色,常溫攪拌2 h,生成深藍色絮狀物。使用1∶1的水和乙醇分別洗滌和離心6次,轉速為8000 r/min,10 min。80 ℃真空干燥10 h,用球磨機磨成均勻的粉末顆粒,提高在水溶液中的分散性[20]。

MONFs的結晶性由XRD粉末衍射進行分析,輻射源為Cu靶Ka射線(λ=1.5406 ?),電壓為40 kV,電流為40 mA,掃描范圍為2°～40°,測試在室溫下進行。MONFs的形貌分析通過場發(fā)射電子掃描顯微鏡觀察,冷場發(fā)射槍,電壓為10 kV。

1.2.2 辣根過氧化物酶-金屬有機骨架納米纖維生物傳感器的制備 構筑HRP-MONFs/Chit/GCE電化學傳感器過程通過示意圖1表示,使用不同粒徑的氧化鋁打磨玻碳電極(GCE,3mm),分別用乙醇和水超聲清洗三次,氮氣吹干;將10 μL辣根過氧化物酶(10 mg/mL)溶液加入20 μL MONFs(5 mg/mL)水溶液中混合,在低溫、200 r/min條件下搖床10 h;加入10 μL殼聚糖溶液(6 mg/mL,pH6.0),震蕩3 min。將5 μL混合溶液滴涂在電極表面,電極低溫晾干后,4 ℃儲存在0.05 mol/L PBS(pH7.5)中。

圖1 辣根過氧化物酶-金屬有機骨架 納米纖維生物傳感器示意圖Fig.1 Schematic illustrations for HRP-MONFs/Chit/GCE

1.2.3 辣根過氧化物酶-金屬有機骨架納米纖維生物傳感器的電化學測試

1.2.3.1 阻抗分析 在含有5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中,對不同電極進行電化學阻抗分析,電壓為開路電壓,頻率范圍為0.1～105Hz,振幅5 mV,阻抗數據通過ZVIEW軟件進行擬合。

1.2.3.2 循環(huán)伏安特性分析 酶電極在0.1 mol/L磷酸緩沖液、0.1 mol/L含有1.0 mmol/L對苯二酚的磷酸緩沖液、0.1 mol/L含有1.0 mmol/L對苯二酚和0.1 mmol/L過氧化氫的磷酸緩沖液進行循環(huán)伏安法分析,電壓范圍相對于參比電極(飽和甘汞電極SCE)為-0.8～0.8 V。使用含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L對苯二酚的0.1 mol/L PBS(pH7.5)溶液作為過氧化氫檢測體系溶液,使用不同修飾程度的殼聚糖電極(Chit/GCE)、MOFs修飾電極(MONFs/Chit/GCE)及MONFs固定化酶電極(HRP-MONFs/Chit/GCE)進行循環(huán)伏安法分析,掃描速度為50 mV·s-1,電壓范圍相對于參比電極(飽和甘汞電極SCE)為-0.8～0.8 V。

1.2.3.3 酶電極電化學行為分析與優(yōu)化 使用含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L對苯二酚的0.1 mol/L PBS(pH7.5)溶液作為過氧化氫檢測體系溶液,HRP-MONFs/Chit/GCE酶電極使用不同掃描速度進行循環(huán)伏安分析,掃描速度范圍為50～400 mV·s-1,電壓范圍為-0.8～0.8 V。電解液的pH和MONFs量的優(yōu)化依據循環(huán)伏安法測定的酶電極還原峰的峰值電流進行分析,電解液pH范圍為6.0～8.0,MONFs量為1～10 mg/mL,電解液為含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L對苯二酚的0.1 mol/L PBS溶液。

1.2.3.4 構建校準曲線 采用安培電流-時間方法來建立酶電極電流信號對過氧化氫濃度的校準曲線,檢測實施在10 mL被攪拌的0.1 mol/L PBS(pH7.5),應用峰值電位為-0.1V。采用安培電流-時間方法來建立酶電極電流信號對過氧化氫濃度的校準曲線,添加的過氧化氫濃度為12.5、25、50、62.5、125 μmol/L,每次添加量為25 μL。

1.2.3.5 檢測雞爪和牛奶中的過氧化氫殘留 雞爪的可食部分通過高速多功能粉碎機(34000 r/min)粉碎均勻,稱取10 g(精確到0.01g),加適量水溶解,轉移入100 mL容量瓶中,搖勻,浸泡40 min,用濾紙過濾,濾液作為試樣液備用。雞爪試樣液和牛奶原液利用酶電極通過安培電流-時間法測試是否含有過氧化氫,然后添加過氧化氫并配制成不同過氧化氫濃度(12.5、50和125 μmol/L H2O2)的牛奶測試溶液和雞爪提取溶液,每種過氧化氫濃度樣品至少三個平行,通過安培電流-時間法測試酶電極的回收率。

1.2.3.6 酶傳感器穩(wěn)定性和選擇性分析 酶電極穩(wěn)定性通過使用酶電極在最優(yōu)條件下,對過氧化氫反應體系(含有0.1 mmol/L H2O2和1 mmol/L對苯二酚的0.1 mol/L PBS,pH7.5)進行循環(huán)伏安檢測,計算30 d內電流信號的變化。酶傳感器的選擇性評估是在10 mL被攪拌的0.1 mol/L PBS(pH7.5)中進行電流-時間曲線測試,分別添加25 μL 100 μmol/L的過氧化氫、葡萄糖、尿素、檸檬酸溶液,應用電位為-0.1 V。

1.3 數據處理

阻抗數據通過ZVIEW軟件擬合分析得到。使用相對標準偏差分析檢測結果的精密度,相對標準偏差(RSD)=標準偏差(SD)/計算結果的算術平均值(X)×100%。

2 結果與分析

2.1 合成的MONFs表征

圖2A為MONFs的XRD圖。MONFs在2θ=10.93°、14.85°、19.88°、24.75°、26.32°和28.65°具有較強的衍射峰,材料具有高結晶性。SEM形貌分析顯示MONFs擁有均一、規(guī)則的幾何構型,為200 nm寬度,10 μm長度的纖維狀結構(圖2B)。根據前期工作的研究,該MONFs在200 ℃以下具有很好的結構穩(wěn)定性[20];另外,MONFs使用了天冬氨酸作為配體有機鏈,MONFs表面含有豐富的羧酸基團,具有好的生物兼容性,提供了很好的平臺來固定化辣根過氧化物[20]。

圖2 MONFs的結構表征圖Fig.2 Structural characterization of MONFs注:XRD(A);SEM(B)。

2.2 辣根過氧化物酶-金屬有機骨架納米纖維生物傳感器的制備

為了表述電極裝備過程,使用了電化學阻抗法(EIS)測試了不同電極的表界面性質。圖3為裸玻碳電極(GCE)、Chit/GCE、MONFs/Chit/GCE及HRP-MONFs/Chit/GCE的奈奎斯特圖,通過等效電路圖擬合得到,裸玻碳電極阻抗值為55 Ω,代表了裸電極界面[Fe(CN)6]3-/4-傳荷過程控制的電極阻抗;當電極修飾上殼聚糖后,Rct為75 Ω,界面阻抗有所增加,但阻抗值增加很小,表明殼聚糖作為成膜劑,具有很好的電子傳遞能力;MONFs/Chit/GCE因為修飾的MOFs所具有的特殊的表面性質和復雜的孔道網絡結構,改變了表界面性質,阻抗增加到1.7 kΩ,固定化上HRP后酶電極(HRP-MONFs/Chit/GCE)阻抗增加到5.4 kΩ,表明了HRP成功的固定化;增長的阻抗值主要是因為導電性差的酶分子對界面電子的傳遞位阻、靜電相互作用。不同電極阻抗值的增加體現了電極的不斷修飾過程。

圖3 不同電極的奈奎斯特圖Fig.3 Nyquist plot of different electrodes注:a.裸玻碳電極(GCE);b.Chit/GCE; c.MONFs/Chit/GCE;d.HRP-MONFs/Chit/GCE。

2.3 酶電極的循環(huán)伏安特性

HRP-MONFs/Chit/GCE如圖4中a線所示,在循環(huán)伏安法掃描測試中只有還原峰,而無明顯氧化峰,為不可逆反應,且隨著掃描次數的增加,酶催化活性逐步消失,這是因為酶的活性中心電子傳導能力弱,不能及時恢復活力。如b線所示,添加對苯二酚作為氧化還原中間傳遞體后,在較低電位下有可逆的氧化與還原峰,構筑了一個完整的氧化還原反應體系[3]。添加0.1 mmol/L過氧化氫后,酶電極對過氧化氫有敏感變化,在-0.1V有明顯的還原峰的增大,因酶催化過氧化氫的還原,形成更多的氧化態(tài)的酶,如圖1所示,反應體系中的對苯二酚還原了酶的氧化態(tài),使酶的活性恢復,生成了更多的對苯醌,造成了對苯二酚的還原峰的急劇增加,通過定量測定對苯醌還原電位的電化學電流,來定量檢測過氧化氫濃度變化[19]。

圖4 HRP-MONFs/Chit/GCE 在不同檢測溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 CV curves of HRP-MONFs/Chit/GCE cycled in different detection solution注:a:0.1 mol/L磷酸緩沖液;b:0.1 mol/L含有1.0 mmol/L對苯二酚的磷酸緩沖液;c:0.1 mol/L含有1.0 mmol/L對苯二酚以及0.1 mmol/L過氧化氫的磷酸緩沖液。

通過采用0.1 mol/L PBS與1 mmol/L HQ(對苯二酚)及0.1 mmol/L的H2O2的電化學反應體系,從圖5可以看出:MONFs/Chit/GCE雖然具有更高的阻抗值,但氧化還原峰相比于Chit/GCE更大,體現了MONFs很好的底物濃度聚集能力。Chit/GCE與MONFs/Chit/GCE氧化峰與還原峰峰值電流相同,峰值電位無變化,表明對過氧化氫無催化效果,而HRP-MONFs/Chit/GCE在-0.1V的還原峰明顯增大,氧化峰明顯減小,且峰位電流發(fā)生了偏轉,表現了酶對過氧化氫明顯的特異性催化效果,導致了對苯醌還原電流的變化。所制備的HRP-MONFs/Chit/GCE具有很好的對過氧化氫的催化能力。

圖5 不同電極在過氧化氫檢測溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.5 CV of different electrodes in detection solution containing H2O2注:a：Chit/GCE;b：MONFs/Chit/GCE; c:HRP-MONFs/Chit/GCE。

2.4 酶電極電化學行為與優(yōu)化

如圖6所示,酶電極為工作電極,以不同掃描速度進行循環(huán)伏安掃描,可以看出峰電位基本不變,峰電流隨著掃描速度增加而增加。從圖7所示,峰值電流隨掃描速度從50～400 mVs-1成線性增加。表明了該反應體系中,酶電極為受擴散傳質控制的反應過程,界面反應速度受傳質速度的影響,傳質控制方式與其他使用電子傳遞中間體傳遞電子的酶傳感器報道相同[21]。

圖6 HRP-MONFs/Chit/GCE在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.6 CV curves of HRP-MONFs/Chit/ GCE at different scan rates

圖7 HRP-MONFs/Chit/GCE不同掃速下 峰值電流與掃速關系圖Fig.7 Plot of cathodic and anodic peak current for HRP-MONFs/Chit/GCE versus scan rateat different scan rates

酶傳感器的性能優(yōu)化通過調節(jié)電解液的pH及MONFs量來進行。因為酶的活性易受環(huán)境pH的影響,所以電解液pH對酶電極的能力有很大影響。從圖8可以看出,酶電極的峰值電流從pH5.5開始增長,在pH7.5達到最大值,在pH8處峰值電流降低。另外,固定化HRP的量受到MONFs量的影響很大,從含有不同濃度MONFs以及相同濃度HRP的不同酶電極CV峰值電流變化圖9中可以看出峰值電流在2 mg/mL MONFs處取得最大值,酶與MONFs的比率為5∶2,表明在該濃度下,在該比率下,固定化酶的量達到最大,因此2 mg/mL的MONFs和 PBS(pH7.5)被用于酶電極的制備以及在反應體系的分析。

圖8 底物溶液pH對HRP-MONFs/ Chit/GCE峰值電流的影響Fig.8 Effects of PBS buffer's pH on the cathodic peak current of HRP-MONFs/Chit/GCE

圖9 MONFs濃度對HRP-MONFs/ Chit/GCE峰值電流的影響Fig.9 Effects of concentrations of MONFs on the cathodic peak current of HRP-MONFs/Chit/GCE

2.5 酶電極構建校準曲線

電流-時間的曲線方法作為恒電壓電化學分析方法,通過使用酶電極檢測加入一系列不同濃度的過氧化氫,電流的變化,來構建電流校準曲線。圖10為在-0.1 V的反應電位下,不斷添加過氧化氫到PBS溶液中酶電極的電流變化,可以看出HRP-MONFs/Chit/GCE對過氧化氫具有很好的響應性,產生階躍電流,且在3 s內達到95%穩(wěn)定狀態(tài)電流。圖11為HRP-MONFs/Chit/GCE相應的校準曲線,響應電流具有很好的線性關系,線性范圍為12.5～675 μmol/L,線性回歸方程為Y=0.02271X + 0.96919(R2=0.999)。另外,HRP-MONFs/Chit/GCE有一個很低的檢測線為0.97 μmol/L,基于3 S/N。

圖10 HRP-MONFs/Chit/GCE對H2O2響應I-T曲線Fig.10 Amperometric responses of HRP-MONFs/Chit/GCE upon successive additions of H2O2

圖11 電流響應與H2O2濃度校準曲線Fig.11 Calibration curve of amperometric responses at different H2O2 concentrations

2.6 辣根過氧化物酶-金屬有機骨架納米纖維生物傳感器在食品中實際應用

目前的工作選用雞爪和牛奶作為固態(tài)食品和液態(tài)食品的代表來研究該酶傳感器在食品中的應用。添加牛奶和雞爪空白溶液,HRP-MONFs/Chit/GCE均未有明顯響應,呈過氧化氫陰性。表1為隨著添加帶有12.5、25、50 μmol/L過氧化氫濃度的牛奶和雞爪提取液,HRP-MONFs/Chit/GCE測得的樣品濃度的回收率。對于在雞爪和牛奶樣品中不同濃度的H2O2,回收率范圍為94%～107%。結果表明,該構建的傳感器是非常穩(wěn)定和準確地定量檢測食品中過氧化氫的工具,具有進一步應用的潛質。

2.7 酶傳感器的穩(wěn)定性與選擇性

從圖12可以看出,HRP-MONFs/Chit/GCE不使用時,儲存在0.05 mol/L PBS、4 ℃條件下,在24 d,HRP-MONFs/Chit/GCE能夠保持其初始94%左右的性能,HRP-MONFs/Chit/GCE表現了較好的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。在0.1 mol/L PBS(pH7.5)中進行電流-時間曲線測試,分別添加同等濃度100 μmol/L的過氧化氫、葡萄糖、尿素、檸檬酸溶液(圖13),在50 s時添加25 μL過氧化氫溶液,電流從-2.1 μA階躍至-10.2 μA,并在3 s內達到穩(wěn)定狀態(tài),該傳感器對過氧化氫具有快速的反應能力,而加入同樣體積的干擾物,電流并沒有發(fā)生明顯變化,說明添加物均無干擾,該傳感器具有較好的選擇性。

表1 牛奶和雞爪樣品中過氧化氫測定(n=3)Table 1 Determination of hydrogen peroxide in milk and chicken feet solution(n=3)

圖12 HRP-MONFs/Chit/GCE儲存穩(wěn)定性變化圖Fig.12 Storage stability of HRP-MONFs/Chit/GCE

圖13 HRP-MONFs/Chit/GCE選擇性測試曲線Fig.13 Selectivity test of HRP-MONFs/Chit/GCE

3 結論

本研究合成了一種新型HRP固定化材料,制備了電化學酶傳感器檢測食品中的過氧化氫。合成的金屬骨架納米纖維具有較好的生物兼容性且HRP與金屬骨架納米纖維取得了較好的固定化效果;制備的酶傳感器對過氧化氫具有較好的電催化能力,通過檢測電化學媒介體對苯醌還原電流的變化,建立了快速靈敏檢測過氧化氫含量變化的電化學定量方法。該傳感器在12.5～675 μmol/L范圍有較好的線性范圍,最低檢測限為0.97 μmol/L,有較高的穩(wěn)定性和選擇性,且成功的應用于檢測食品中過氧化氫殘留(固態(tài)食品和液態(tài)食品)。