多序列比對(duì)在克隆表達(dá)一株未知芽孢桿菌角蛋白酶基因中的應(yīng)用

蔣少龍,郭依依,蔡 俊

(湖北工業(yè)大學(xué),發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430068)

角蛋白酶是一種底物非常廣的蛋白酶,如膠原蛋白、纖維蛋白、牛乳清蛋白、血紅蛋白、酪蛋白等,同時(shí)還能夠高效降解天然的角蛋白,并且作用條件溫和,是一種降解利用角蛋白的綠色方式[1]。不僅如此,角蛋白酶還被發(fā)現(xiàn)能夠降解頑固的朊病毒,使得角蛋白酶成為目前的研究熱點(diǎn)之一[2]。

產(chǎn)角蛋白酶的微生物多種多樣,包括細(xì)菌、放線菌和真菌都有著大量產(chǎn)角蛋白酶的群體[3-5],同一個(gè)屬的微生物由于親緣關(guān)系接近,其產(chǎn)生的角蛋白酶序列在進(jìn)行多序列比對(duì)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了明顯的親緣關(guān)系,而利用這種親緣關(guān)系可以設(shè)計(jì)出擴(kuò)增這些角蛋白酶的簡(jiǎn)并引物,然后再對(duì)這些角蛋白酶基因進(jìn)行基因工程研究。序列比對(duì)是生物信息學(xué)研究的重要方法之一,它通過(guò)對(duì)DNA和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性比較,直觀地顯示序列間的保守區(qū)域和不同之處,分析基因進(jìn)化關(guān)系[6-7],是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物前必不可少的分析步驟。

本實(shí)驗(yàn)室保藏有一株能夠在以羽毛粉為唯一碳氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的芽孢桿菌CDJYB(16S rRNA比對(duì)結(jié)果顯示其為芽孢桿菌屬),其于養(yǎng)雞場(chǎng)附近的泥土中篩選得到,現(xiàn)對(duì)芽孢桿菌CDJYB的角蛋白酶基因進(jìn)行原核表達(dá),但因其種名未知,而無(wú)法從NCBI上直接找到編碼其角蛋白酶的基因序列。由于不同屬物種間親緣關(guān)系較差,序列比對(duì)結(jié)果差異大,所以通過(guò)多序列比對(duì)設(shè)計(jì)兼并引物的方式可能僅限于在同屬的微生物中進(jìn)行,本文通過(guò)對(duì)芽孢桿菌屬來(lái)源的角蛋白酶基因進(jìn)行分類(lèi)比對(duì),篩選一株未知芽孢桿菌的角蛋白酶基因,并在大腸桿菌中克隆表達(dá),最后再通過(guò)SDS-PAGE分析和酶活測(cè)定驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。

表1 角蛋白酶序列信息Table 1 Keratinase amino acid sequence information

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢菌CDJYB、大腸桿菌BL21、大腸桿菌DH5α、pET-28a質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)室保藏;pGM-T、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;Taq DNA聚合酶、T4連接酶、瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、DNA marker DL2000、DNA marker DL10000 寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;Gold View I核酸染料、蛋白質(zhì)marker 賽默飛世爾科技有限公司;氨芐青霉素(Amp)、硫酸卡那霉素(Kana)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺 艾萬(wàn)拓威達(dá)優(yōu)爾國(guó)際貿(mào)易有限公司;甲叉雙丙烯酰胺 西格瑪奧德里奇;Tris 索萊寶科技有限公司;酪氨酸 武漢市華順生物技術(shù)有限公司;福林酚試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;底物角蛋白(部分磺化) 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;其他常用試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AR1140電子分析天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;ZSD-1270全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;DYCP-31BN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;Applied BiosystemsTMPCR熱循環(huán)儀、Freso高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司;凝膠成像儀、SYNERGY2酶標(biāo)儀 基因有限公司;蛋白質(zhì)電泳儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 肉湯培養(yǎng)基(1 L):取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏和5 g NaCl,溶于1 L的水中。

LB培養(yǎng)基(1 L):取5 g酵母粉、10 g胰蛋白胨和5 g NaCl,溶于1 L的水中,制成平板時(shí)加入1.5%的瓊脂,抗性篩選時(shí)加入終濃度為100 g/mL氨芐青霉素(Amp)或者30 g/mL硫酸卡那霉素(Kana)。

1.2.2 利用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)未知角蛋白酶基因的簡(jiǎn)并引物

1.2.2.1 多種來(lái)源的角蛋白酶序列進(jìn)化樹(shù)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了多個(gè)被報(bào)道過(guò)有著角蛋白酶活性的角蛋白酶序列(半數(shù)為芽孢桿菌),17個(gè)NCBI序列號(hào)分別為:AKN20219.1、ACM47735.1、AGO58466.1、AAY82467.1、AIY62812.1、ACN82379.1、AAU94349.1、ADP00718.1、AEI83225.1、AFG35419.1、ABU96301.1、AAG00492.1、AKR05134.1、APS24128.1、ADP00719.1、C4YSF6.1、P0DJ06.1,其信息如表1,并使用MAGE6軟件下的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[8]。

1.2.2.2 芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶多序列比對(duì) 由于是設(shè)計(jì)芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶基因的簡(jiǎn)并引物,所以只選擇17個(gè)序列中芽孢桿菌屬來(lái)源的角蛋白酶序列進(jìn)行多序列對(duì)比,由Clustalx(其原理基于漸進(jìn)法,對(duì)序列進(jìn)行相似性比較,注意Clustalx無(wú)法打開(kāi)根目錄存在中文的文件)完成比對(duì)[26],DNAMAN完成圖片輸出,軟件操作流程為:將序列號(hào)列在1個(gè)TXT格式文件中→利用NCBI的Batch Entrez功能,將所有角蛋白酶的氨基酸序列全部下載到1個(gè)FASTE格式文件中→利用Clustalx打開(kāi)FASTE格式文件,點(diǎn)擊Alignment,Do Complete Alignment,將會(huì)生成.dnd和.aln文件→打開(kāi)DNAMAN,點(diǎn)擊File,Open Special,Multiple Alignment,選擇本次的.aln文件打開(kāi)→點(diǎn)擊Options設(shè)置適當(dāng)?shù)妮敵龈袷?最后點(diǎn)擊Output,選擇Graphic(EMF)File。并將對(duì)比結(jié)果結(jié)合進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析序列關(guān)系,若某些序列存在,嚴(yán)重影響整體的相似度,需要將這些序列另整合至一個(gè)文件里,并進(jìn)行多序列比對(duì),繼續(xù)篩選出其中差異較大的序列,此時(shí)就可以將角蛋白酶序列進(jìn)行分組,并且適當(dāng)利用BLAST來(lái)填補(bǔ)每組的序列數(shù)目。

1.2.2.3 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)對(duì)比結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)分析,將獲得的芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶序列分類(lèi),同時(shí)對(duì)應(yīng)的基因序列也需要進(jìn)行多序列對(duì)比驗(yàn)證。選擇連續(xù)6個(gè)或以上氨基酸都相同的區(qū)域,且每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子上三個(gè)堿基中至少有兩個(gè)相同,這些區(qū)域?qū)?huì)是用來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便引物的候選區(qū)域,引物合成由南京金斯瑞完成。

1.2.3 角蛋白酶基因完整序列的PCR擴(kuò)增

1.2.3.1 芽孢桿菌的培養(yǎng)及其全基因組的提取 將保藏于4 ℃的芽孢桿菌CDJYB菌株接入到肉湯固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h,然后轉(zhuǎn)接一環(huán)活化了的芽孢桿菌CDJYB到5 mL肉湯液體培養(yǎng)基中,180 r/min培養(yǎng)12 h。并參照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒來(lái)提取芽孢桿菌CDJYB全基因組。

1.2.3.2 角蛋白酶基因的擴(kuò)增 簡(jiǎn)并引物以芽孢桿菌全基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR,PCR體系(50 μL)含ddH2O 36 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 2 μL,A-F 2 μL,A-R 2 μL,全基因組1 μL,Taq DNA Polyase 2 μL,退火溫度A1為45 ℃,A2為50 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序后,取中間可信程度高的片段發(fā)送到NCBI進(jìn)行BLAST,得到一個(gè)相似度100%的完整的角蛋白酶基因,設(shè)計(jì)不含自身信號(hào)肽的引物,以芽孢桿菌全基因組DNA為模板,擴(kuò)增角蛋白酶基因,擴(kuò)增條件與上面上述基本一致,退火溫度為48 ℃。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳分析,并使用TAKARA的DNA凝膠回收試劑盒純化回收,測(cè)序由南京金斯瑞公司完成。

1.2.4 角蛋白酶基因的克隆 回收得到的PCR產(chǎn)物利用TA克隆的方式與pGM-T載體連接,采用10 μL連接體系:ddH2O 5 μL,PCR產(chǎn)物2.5 μL,pGM-T 0.5 μL,10×T4DNA ligation buffer 1 μL,T4DNA ligase 1 μL。連接體系混合均勻后,置于16 ℃低溫水浴鍋過(guò)夜。將連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化至克隆宿主DH5α,具體操作:將10 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL剛解凍的大腸桿菌感受細(xì)胞中,輕輕吹打均勻,冰浴處理 30 min,42 ℃熱激90 s,接著再冰浴處理2 min,加入250 μL新鮮的LB培養(yǎng)液,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1 h,最后將轉(zhuǎn)化混合物均勻的涂布在LB平板(含100 μg/mL的Amp)上。

運(yùn)用菌落PCR以及質(zhì)粒雙酶切(BamHI和XhoI)來(lái)篩選出生長(zhǎng)在LB平板(含100 μg/mL的Amp)上的陽(yáng)性克隆子,具體步驟:挑取白色的菌落接入 LB 培養(yǎng)液中(含100 g/mL的Amp)在 180 r/min,37 ℃的揺床中培養(yǎng)7～9 h,吸取0.5 L的菌液作為模板進(jìn)行PCR,PCR體系(25 L)含ddH2O 17 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,T7 promoter primer和SP6 promoter primer各1 μL,菌液0.5 μL,Taq DNA Polyase 1 μL,其退火溫度50 ℃。使用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。接著利用質(zhì)粒小提試劑盒提取PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性菌落的培養(yǎng)物的質(zhì)粒,再將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng),具體操作:取質(zhì)粒樣品5 μL、10×K buffer 1 μL、對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI各0.5 μL,補(bǔ)充ddH2O至10 μL,將反應(yīng)體系輕輕吹打均勻后,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 h,使用瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

大量提取質(zhì)粒PGM-T-Ker,并使用BamHI和XhoI對(duì)pGM-T-Ker和pET-28a分別進(jìn)行線性化處理,再利用DNA凝膠提取試劑盒回收帶有粘性末端的角蛋白酶片段和線性化后的pET-28a,并使用T4連接酶連接兩者,最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21,運(yùn)用菌落PCR以及雙酶切來(lái)篩選LB平板(含30 μg/mL的Kana)上的陽(yáng)性克隆子,具體的連接轉(zhuǎn)化及篩選方法與上述相似,菌落PCR采用的引物為T(mén)7promoter primer和T7terminator primer,退火溫度50 ℃。

圖1 部分角蛋白酶氨基酸序列分子系統(tǒng)樹(shù)Fig.1 Molecular phylogenetic tree of partial keratinase amino acid sequences注:數(shù)字為置信度,僅顯示70%以上的置信度。

1.2.5 重組大腸桿菌BL21(pET-28a-CDJYB)誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 挑選重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)單菌落在的LB培養(yǎng)基(含有30 g/mL Kana)中,37 ℃ 180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)12 h,然后按照1%(v/v)接種到50 mL的LB培養(yǎng)基(含有30 g/mL Kana)中,37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,置于37 ℃下過(guò)夜誘導(dǎo)16 h后準(zhǔn)備收集菌體,9000 r/min下離心5 min,棄上清液,用5 mL的50 mmol/L pH10.0 Tris-HCl緩沖液重懸菌體,在冰浴條件下超聲破碎,超聲破碎的程序?yàn)?工作2 s,間歇3 s,功率200 W,共99個(gè)循環(huán)。超聲處理后的樣品在9000 r/min下離心20 min,收集上清,沉淀使用適量Tris-HCl(pH10.0)重懸并收集,將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析,使用大腸桿菌BL21(pET-28a)作為對(duì)照組。

1.2.6 不同溫度條件下的蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE分析及酶活測(cè)定

1.2.6.1 蛋白表達(dá)量的SDS-PAGE分析 由于在37 ℃時(shí),表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在,通過(guò)適當(dāng)降低溫度,使角蛋白酶可溶性表達(dá),本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同誘導(dǎo)溫度來(lái)摸索最佳溫度條件,分別設(shè)置15、20、25、30 ℃四個(gè)梯度。取出在-80 ℃下甘油凍存的菌液,先后于 20 ℃和4 ℃解凍,以2%接種量接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL的Kana)中培養(yǎng)12 h,再以1%的接種量接種至50 mL的液體培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6之間,加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG,并將三角瓶分別放置到15、20、25、30 ℃的搖床(溫度預(yù)先調(diào)好)中,180 r/min誘導(dǎo)16 h,收菌后超聲處理,離心分別收集上清和沉淀,準(zhǔn)備SDS-PAGE分析目的蛋白可溶性表達(dá)情況。

表2 酪氨酸福林酚反應(yīng)表格Table 2 ReactionTable of tyrosine and forin phenol reagent

1.2.6.2 酪氨酸福林酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及角蛋白酶酶活的測(cè)定 取5只5 mL的離心管,依次按照表2所示加樣,混勻并于40 ℃水浴中顯色20 min,以1號(hào)為空白,分別吸取200 μL反應(yīng)樣品于96孔板,使用酶標(biāo)儀在680 nm下檢測(cè)吸收光。

酶活測(cè)定方法:此方法參考自蔣彪等[27]并結(jié)合國(guó)標(biāo)法(GB/T23527-2009)加以改進(jìn),取不同溫度下誘導(dǎo)的粗酶液1 mL于5 mL離心管中,加入1 mL的1%(w/v)角蛋白底物(5%的角蛋白用50 mmol/L pH10的Tris-HCl稀釋),50 ℃水浴20 min,2 mL的0.4 mol/L的TCA終止反應(yīng),9000 r/min,離心10 min,取上清1 mL,加入4 mL的0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL的福林酚試劑,40 ℃水浴顯色20 min,取反應(yīng)液200 μL于96孔板用酶標(biāo)儀在680 nm下檢測(cè)吸收光,對(duì)照組在加入底物前加入TCA。

酶活定義:50 ℃和pH10的條件下,1 min內(nèi)每釋放1 μg的酪氨酸為一個(gè)酶活單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為Mean±SD,分別采用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 角蛋白酶序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

如圖1,由進(jìn)化樹(shù)分析可以知道芽孢桿菌屬來(lái)源的角蛋白酶都集中在一個(gè)簇里面,但是Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis來(lái)源的角蛋白酶聚在一起,似乎與其他芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶存在些許進(jìn)化差異,為了簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性,需要進(jìn)一步用多序列比對(duì)來(lái)檢驗(yàn)相似度。

2.2 角蛋白酶序列多序列比對(duì)

多序列比對(duì)結(jié)果如圖2,發(fā)現(xiàn)當(dāng)Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis來(lái)源的角蛋白酶存在時(shí),嚴(yán)重影響了整體相似度,且Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis來(lái)源的角蛋白酶之間卻存在較高的相似度,所以決定將收集到的芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶序列分為兩類(lèi),并分別設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并引物,確保能夠準(zhǔn)確定位未知芽孢桿菌中的角蛋白酶基因。

圖2 部分芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment algorithm of keratinase amino acid sequences from partial Bacillus

表3 簡(jiǎn)并引物信息Table 3 The information of degenerate primer

2.3 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)

簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)序列見(jiàn)表3,將AAY82467.1[Bacilluslicheniformis]、ACM47735.1[Bacilluspumilus]、AGO58466.1[Brevibacillusbrevis]、AIY62812.1[Bacillussubtilis]、AKN20219.1[Bacillustequilensis]、AKR05134.1[Bacillusamyloliquefaciens]6種角蛋白酶及其對(duì)應(yīng)的基因序列分別做多序列比對(duì),最終挑選MDVINMS、PHVAGAA作為引物設(shè)計(jì)的保守區(qū),并設(shè)計(jì)第一對(duì)簡(jiǎn)并引物A1-F:5′-ATGGAYGTYATYAAYATGAGC-3′,A1-R:5′-GCYGCTCCBGCWACRTGMGG-3′,能夠擴(kuò)增得到大小為338 bp的片段。

將APS24128.1[Bacillusthuringiensis]和AEI83225.1[Bacilluscereus]在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里做BLAST,查找出大量的未被發(fā)現(xiàn)具有角蛋白酶功能的S8家族肽酶(與前兩個(gè)角蛋白酶序列相似度在99%或以上),挑選部分肽酶序列(WP_098524071.1[Bacillusanthracis]、WP_044584435.1[Bacillusbombysepticus]、WP_098803463.1[Bacillustoyonensis]、WP_060488697.1[Bacilluswiedmannii]、AJI16229.1[Bacilluspseudomycoides]),并找到其對(duì)應(yīng)的基因序列,7個(gè)蛋白序列及其對(duì)應(yīng)的基因序列分別做多序列比對(duì),最終挑選GSGTLDA、SMATPH(/Q)V作為引物設(shè)計(jì)的保守區(qū),設(shè)計(jì)第二對(duì)簡(jiǎn)并引物,A2-F:5′-AGGWAGYGGKACTCTYGATGC-3′,A2-R:5′-RTTHCCKGCBGCVGCHRCVAC-3′,能夠擴(kuò)增得到大小為372 bp的片段。

2.4 蛋白酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以芽孢桿菌CDJYB的全基因組為模板,A1-F、A1-R為引物,成功擴(kuò)增出一條200～500 bp之間的特異性條帶,如圖3,而簡(jiǎn)并引物A2則沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶(結(jié)果未給出)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST得到序列JX504681.1(1053 bp),被確認(rèn)為目標(biāo)角蛋白酶基因序列,并通過(guò)該序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物(去除自身信號(hào)肽)CDJYB-28aF:CGGGATCC(BamHI)GCTCAGCCGGCGAAAAAT和CDJYB-28aR:CGCCTCGAG(XhoI)TTATTGAGCGGCAGCTTCGA,其PCR結(jié)果如圖4所示,得到一個(gè)1000 bp左右的條帶,大小與JX504681.1接近。

圖3 以簡(jiǎn)并引物A1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis analysis of PCR products using degenerate primer A1注:M:DNA Marker;1:簡(jiǎn)并引物A1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。

圖4 角蛋白酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR products of keratinase注:M:DNA Marker;1:角蛋白酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.5 克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

能夠編碼完整角蛋白酶的基因通過(guò)TA克隆的方式克隆到pGM-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)過(guò)菌落PCR初篩,再使用BamHI和XhoI雙酶切進(jìn)行復(fù)篩,如圖5,角蛋白酶基因成功連接到pGM-T載體獲得質(zhì)粒pGM-T-Ker,且測(cè)序結(jié)果表明,該基因序列全長(zhǎng)1053 bp,與NCBI中Bacilluslicheniformisstrain BBE11-1來(lái)源的角蛋白酶基因序列(JX504681.1)一致。將質(zhì)粒PGM-T-Ker經(jīng)過(guò)雙酶切后,回收帶有粘性末端的角蛋白酶基因片段,并與帶有同樣粘性末端的pET-28a載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,獲得pET-28a-Ker,如圖6,證明成功構(gòu)建表達(dá)載體。

圖5 PGM-T-Ker雙酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Electrophoresis analysis of PGM-T-Ker after being double digested注:M:DNA Marker;1:PGM-T-Ker的雙酶切產(chǎn)物。

圖6 pET-28a-Ker雙酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Electrophoresis analysis of pET-28a-Ker after being double digested注:M:DNA Marker;1:pET-28a-Ker的 雙酶切產(chǎn)物;2:目的基因。

2.6 重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖7 37 ℃下IPTG誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.7 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE) analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 37 ℃注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:BL21(pET-28a)在37 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在37 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀。

重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果如下圖7所示,重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃,180 r/min誘導(dǎo)16 h后,角蛋白酶成功以包涵體的形式表達(dá),第4泳道中能夠很清晰的看到一條在35.0～45.0 kDa之間的特異性蛋白帶,符合理論值39.22 kDa(原始分子質(zhì)量為35.61 kDa,融合了部分質(zhì)粒片段)。但是在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的總蛋白上清中沒(méi)有檢測(cè)到任何角蛋白酶活性以及蛋白條帶。

2.7 不同溫度條件下的蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果

重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)分別在15、20、25、30 ℃四個(gè)溫度梯度下誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如下圖8和圖9,但是均未發(fā)現(xiàn)明顯的目的條帶,需要進(jìn)一步進(jìn)行酶活測(cè)定。

圖8 15和20 ℃下IPTG誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.8 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE)analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 15 and 20 ℃注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:BL21(pET-28a)在15 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在15 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在15 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在15 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;5:BL21(pET-28a)在20 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;6:BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;7:BL21(pET-28a)在20 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;8:BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀。

表4 不同溫度下誘導(dǎo)的重組菌株總蛋白上清的角蛋白酶酶活Table 4 Keratinase activity of supernatant of total protein in recombinant strain induced by IPTG at different temperatures

2.8 酪氨酸-福林酚反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線及角蛋白酶酶活測(cè)定

根據(jù)酪氨酸與福林酚的顯色反應(yīng),繪制了酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖10,得到了換算系數(shù),以及結(jié)合酶活測(cè)定的方案,得出計(jì)算酶活的方程式:(ΔA×4×N)/(0.0068×20)。ΔA為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光值之差,N為酶液的稀釋倍數(shù)。

圖9 25和30 ℃下IPTG誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.9 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE)analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 25 and 30 ℃注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:BL21(pET-28a)在25 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在25 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在25 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在25 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;5:BL21(pET-28a)在30 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;6:BL21(pET-28a-Ker)在30 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白的上清;7:BL21(pET-28a)在30 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀;8:BL21(pET-28a-Ker)在30 ℃經(jīng)誘導(dǎo)總蛋白沉淀。

圖10 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Standard curve of tyrosine

重組大腸桿菌在15、20、25、30、37 ℃五個(gè)溫度水平下,經(jīng)過(guò)16 h誘導(dǎo)后總蛋白的上清的角蛋白酶活性分別被測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如下表4,結(jié)果顯示重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃的條件下誘導(dǎo),產(chǎn)酶量最高,粗酶液中的角蛋白酶酶活達(dá)到389.7 U/mL,所以使用20 ℃為重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳誘導(dǎo)溫度。

3 結(jié)論與討論

利用多序列比對(duì)的方法,從一株能夠以羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的芽孢桿菌上成功篩選出其角蛋白酶基因,并運(yùn)用分子克隆的手段成功構(gòu)建產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌BL21(pET-28a-Ker),并使用菌落PCR以及雙酶切的手段驗(yàn)證連接轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)確性;使用SDS-PAGE結(jié)合酶活測(cè)定,確定了重組菌株的最佳產(chǎn)酶溫度,確立重組大腸桿菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳誘導(dǎo)溫度為20 ℃下,在誘導(dǎo)16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活達(dá)到389.7 U/mL。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出未知的芽孢桿菌CDJYB的角蛋白酶基因,在一定程度上證明了簡(jiǎn)并引物克隆的實(shí)用性和準(zhǔn)確性,另因這兩對(duì)簡(jiǎn)并引物是根據(jù)13種芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶序列比對(duì)結(jié)果而設(shè)計(jì),涵蓋范圍較廣,能夠定位并擴(kuò)增出大多數(shù)的芽孢桿菌來(lái)源的角蛋白酶基因。另一對(duì)簡(jiǎn)并引物A2也成功篩選并克隆出源于Bacilluscereus的角蛋白酶基因。

不同的底物以及工業(yè)條件,使得研究者需要去開(kāi)發(fā)更多的不同來(lái)源、性質(zhì)的角蛋白酶,而針對(duì)不同種屬的微生物,可以設(shè)計(jì)不同的角蛋白酶簡(jiǎn)并引物,并建立一個(gè)角蛋白酶簡(jiǎn)并引物庫(kù),使得角蛋白酶的研究和開(kāi)發(fā)變得更加方便簡(jiǎn)單,通過(guò)簡(jiǎn)并引物克隆未知來(lái)源目的基因的方法廉價(jià)便捷,可推廣到擴(kuò)增其他基因。