長裙竹蓀多肽抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用

,*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所,四川成都 610061; 2.阿壩州林業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所,四川汶川 623000; 3.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川成都 610068)

竹蓀(Dictyophoraindusiata),隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱(Gasteromycetes)、鬼筆目(Phallales)、鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora),其營養(yǎng)豐富、味道鮮美,是享譽世界的美味食用菌。竹蓀具有滋補強壯、益氣補腦、寧神健腦的功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),竹蓀浸提液含有天然抑菌物質(zhì),能夠有效抑制食源性致病菌增殖[2];竹蓀富含的多酚能有效清除活性氧自由基,具有優(yōu)良的抗氧化活性[3];竹蓀多糖則具有抗氧化[4]、強化免疫、抑制腫瘤的作用[5],能夠有效誘導(dǎo)小鼠腹水瘤S180細(xì)胞凋亡[6],抑制肺癌A549細(xì)胞與宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖[7]。

免疫調(diào)節(jié)肽是指具有增強免疫功能的一類生物活性肽,其作用對象多為巨噬細(xì)胞,通過增強體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌以及促進淋巴細(xì)胞的增殖來起作用[8]。免疫調(diào)節(jié)肽能夠顯著增強機體抵抗外界病毒感染的能力,以此降低機體發(fā)病幾率,保持機體的健康狀態(tài)[9]。近年來,相關(guān)學(xué)者陸續(xù)報道了一些生物源的免疫調(diào)節(jié)肽,海參肽[10]、鳙魚肽[11]等都具有優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)作用。但目前報道的免疫調(diào)節(jié)肽多來自于動物與植物,對于高等真菌免疫調(diào)節(jié)肽的研究較少,在竹蓀屬中尚未見免疫調(diào)節(jié)肽的報道。

基于以上分析,本文采用磷酸鹽緩沖液直接提取法獲得長裙竹蓀水溶性蛋白,3500 Da透析袋透析,分子排阻色譜法(GE,Superdex 30 Increase)分離,反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化,獲得長裙竹蓀多肽(DIP),通過自由基清除能力評估長裙竹蓀多肽的抗氧化活性,進一步通過評價巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬能力和細(xì)胞因子分泌的促進作用來驗證其免疫調(diào)節(jié)作用,為長裙竹蓀的精深加工應(yīng)用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀子實體 采集自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌栽培基地,37 ℃烘箱中烘干待用;RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞系,ATCC Number:TIP71)細(xì)胞 美國ATCC菌種保藏中心;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液 Thermo Scientific公司;青霉素、鏈霉素 美國Sigma公司;一氧化氮、TNF-α、IL-1β、IL-6細(xì)胞因子檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠Toll樣受體檢測試劑盒 上海滬震生物科技有限公司;其余試劑 均為分析純級。

Quest 10中高壓層析系統(tǒng) Bio-rad;Flexar FX-15高效液相色譜 Perkin Elmer;Microfuge 20R高速離心機 Beckman;Forma 3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 Thermo;SpectraMax L酶標(biāo)儀 Molecular Devices;Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機 Christ;N-1210BS-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Eyela;CKX53倒置顯微鏡 Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹蓀多肽提取與純化

1.2.1.1 竹蓀多肽復(fù)合物提取 稱取長裙竹蓀子實體干品20 g,采用中藥材粉碎機粉碎,過100目篩網(wǎng),獲得長裙竹蓀子實體干品粉末。按照長裙竹蓀干品/PBS緩沖液(pH6.8)的料液比1∶20 (g/mL)加樣,加樣后磁力攪拌器120 r/min攪拌過夜,取上清,6000 r/min離心10 min后獲得上清液。選擇截留分子量為3500 Da的透析袋透析12 h,流動相選擇超純水,收集透析液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,獲得的濃縮液采用真空冷凍干燥機冷凍干燥12 h,可獲得長裙竹蓀多肽提取物干粉。竹蓀多肽提取物得率(%)=(竹蓀多肽提取物干粉質(zhì)量/竹蓀子實體干品質(zhì)量)×100。

取長裙竹蓀多肽提取物干粉5 g,無菌水溶解,配制成50 mg/mL的溶液,上樣于Superdex 30 Increase 凝膠過濾柱,無菌水洗脫,部分自動收集器收集洗脫液,215 nm下測定吸光值,收集并凍干單一峰,得到長裙竹蓀子實體多肽復(fù)合物。竹蓀多肽復(fù)合物得率(%)=(竹蓀多肽復(fù)合物干粉質(zhì)量/竹蓀子實體干品質(zhì)量)×100。

1.2.1.2 竹蓀多肽(DIP)分離純化 取長裙竹蓀多肽復(fù)合物干粉1 g,無菌水溶解,配制成10 mg/mL的溶液,反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化,收集單一峰,獲得純化的長裙竹蓀多肽(DIP)。竹蓀多肽得率(%)=(竹蓀多肽干粉質(zhì)量/竹蓀子實體干品質(zhì)量)×100。

色譜條件:PE C18柱(150 mm×4.6 mm),A相:純凈水,B相:含0.1%三氟乙酸的乙腈;流速:1.0 mL/min;進樣量:30 μL;檢測波長:215 nm;柱溫:(25±5) ℃;柱壓:3000 psi;洗脫條件設(shè)定為,A相:0～8 min,99%～97%;8～12 min,97%～96%;12～16 min,96%～80%;16～20 min,80%～99%。收集DIP,純水溶解,配制成濃度為5 mg/mL溶液,進行190～600 nm條件下全波段掃描。

1.2.1.3 竹蓀多肽的基本成分測定 進一步完成并比較長裙竹蓀子實體和提取到的多肽DIP的基本組分。水分按照GB/T 5009.3-2010測定;灰分按照GB/T 5009.4-2010測定;蛋白質(zhì)根據(jù)GB/T 5009.5-2010凱氏定氮法測定;多糖含量測定采用苯酚硫酸法。

1.2.2 DIP自由基清除能力測定 依據(jù)Oktay等[12]的方法完成DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力測定。取DIP 50 mg,無菌水溶解,配制成5 mg/mL母液,進一步將母液稀釋成濃度為5、2.5、1.25、0.63和0.32 mg/mL的待測液。采用濃度為1 mg/mL的VC作為陽性對照,同一測定重復(fù)3次。

1.2.3 DIP對細(xì)胞存活率的影響 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞密度1×105個/mL,每孔100 μL,5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,將細(xì)胞分為8組,每組8個復(fù)孔,分別為對照組,100 μL含血清DMEM培養(yǎng)基;7個DIP組,含有DIP的培養(yǎng)基,DIP的最終濃度依次為3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL,空白孔不接種細(xì)胞,加入100 μL含血清DMEM培養(yǎng)基,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用MTT法測定細(xì)胞存活率。

1.2.4 中性紅吞噬作用評價 取對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞以濃度2×104個/mL鋪96孔板,每孔100 μL。實驗設(shè)定終濃度為10 μg/mL的LPS作為陽性對照,空白組(CK)設(shè)定為:100 μL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液+100 μL細(xì)胞懸液;20 mL DIP+100 μL細(xì)胞懸液+80 μL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液作為處理組,最終保證DIP的終濃度分別為0、3.13、6.25、12.5、25和50 μg/mL,每組均設(shè)立8個復(fù)孔。5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。之后用PBS洗滌3次,加入中性紅溶液100 μL,使中性紅的終濃度為1 μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)30 min。清洗3次后加入裂解液(冰醋酸∶無水乙醇=1∶1)200 μL,靜置過夜,待細(xì)胞裂解完全后,在540 nm波長下測定吸光度值。

1.2.5 對細(xì)胞信號物質(zhì)NO分泌的影響 通過Griess試劑法驗證DIP對RAW264.7細(xì)胞分泌NO的促進作用。取對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞以濃度2×105個/mL鋪24孔板。實驗處理同上,培養(yǎng)細(xì)胞64 h,每隔8 h測定一次NO含量。按照試劑盒說明書進行操作,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,對應(yīng)540 nm下OD值為縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,擬合得出回歸方程,按曲線方程計算各樣品中NO的濃度值。

1.2.6 促細(xì)胞因子分泌活性評價 實驗處理同上,細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,取上清液,使用小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的ELISA試劑盒測定其中的TNF-α,IL-1β和IL-6細(xì)胞因子的濃度,按照試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品擬合線性回歸曲線,得出回歸方程,按曲線方程計算各樣品中細(xì)胞因子的濃度值。

1.2.7 Toll樣受體表達(dá)的影響 RAW264.7細(xì)胞(1×105)接種到24孔板中進行培養(yǎng),實驗設(shè)置同上。培養(yǎng)結(jié)束后,消化并收集細(xì)胞,采用反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞,6000 r/min獲得細(xì)胞裂解液,按照試劑盒說明書要求進行膜表面蛋白Toll樣受體TLR4、TLR9的含量檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行分析,多組均數(shù)比較采用ANOVA檢驗,P<0.05視為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DIP分離純化及基本成分測定

2.1.1 DIP提取分離得率 通過3次重復(fù)試驗,探索DIP的得率。首先,借助磷酸鹽緩沖液提取,20 g長裙竹蓀子實體粉末得到長裙竹蓀多肽提取物干粉6.42 g,得率為32.10%。5 g長裙竹蓀多肽提取物干粉經(jīng)過分子排阻色譜得到長裙竹蓀子實體多肽復(fù)合物干粉0.51 g,得率為2.55%。0.51 g多肽復(fù)合物干粉通過制備型RP-HPLC純化出DIP 0.118 g,得率為0.59%。

圖1 長裙竹蓀多肽分離純化質(zhì)量Fig.1 Isolation and purification yield of DIP

2.1.2 DIP純化及鑒定 分子排阻色譜結(jié)果顯示,透析后的溶液經(jīng)過Superdex 30 Increase柱凝膠過濾后,依次分離出4個組分(圖2A),分子量由大到小編號為A1-4,通過自由基清除活性初篩,收集A3組分作為長裙竹蓀多肽復(fù)合物進行下一步純化。A3上樣RP-HPLC后,共分離出4個組分(圖2B),為B1-4,最終收集B3作為DIP進行下一步實驗。將收集到的B3組分(DIP)配置成濃度為1 mg/mL的溶液進行全波段掃描,獲得DIP掃描圖譜如圖2C所示,DIP在216 nm處出現(xiàn)最大吸收峰,證明DIP是純度較高的多肽。

圖2 長裙竹蓀多肽分離純化Fig.2 Isolation and purification of DIP注:A:分子排阻圖譜;B:RP-HPLC圖譜; C:UV連續(xù)掃描圖譜。

2.1.3 DIP基本成分測定 長裙竹蓀子實體中粗蛋白的含量為21.36%，粗多糖含量為28.85%，現(xiàn)有報道認(rèn)為長裙竹蓀是一種高蛋白、低脂肪，并且具有保健活性的健康食品[1]。通過分子排阻色譜和反相高效液相色譜的分離純化，獲得的DIP中的粗蛋白含量顯著提升，達(dá)到了70.35%，是子實體中粗蛋白含量的3倍，確認(rèn)DIP是一種純度較高的小分子多肽。

2.2 DIP自由基清除活性

DIP對幾種常見的活性氧自由基清除率如圖3所示。DIP對DPPH自由基表現(xiàn)出極強的清除活性,IC50為0.15 mg/mL,與VC相近。DIP對羥自由基具有較好的清除活性,IC50值約為1.18 mg/mL,同樣與陽性對照VC(1.05 mg/mL)相近。DIP對超氧陰離子IC50值約為2.64 mg/mL。

表1 長裙竹蓀子實體和提取多肽(DIP)的基本營養(yǎng)成分Table 1 The nutritional components of the fruiting bodies of Dictyophora indusiata and DIP(g/100 g)

注:*代表同一組分內(nèi)子實體和DIP的顯著性差異,P<0.05。

圖3 DIP自由基清除活性Fig.3 Free radical scavenging activity of DIP注:A為DPPH自由基;B為羥自由基;C為超氧陰離子自由基;D為IC50。不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖4同。

大量研究證實,人體眾多生理活動都受到氧化壓力的影響。氧化壓力會介導(dǎo)諸如炎癥、衰老、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病及腫瘤等多種疾病[13-14]。許多學(xué)者致力于尋找天然抗氧化劑。真菌源抗氧化劑研究較為深入,白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)水提物對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有一定的緩解作用[15],鮑姆木層孔菌(桑黃,Phellinusbaumii)脂溶性提取物具有良好的還原力,可以有效延緩疊氮鈉引起PC12細(xì)胞衰老[16]。就具體活性成分而言,真菌多糖、多酚、黃酮類物質(zhì)是主要抗氧化劑。松茸(Tricholomamatsutake)多糖TMP-A能夠清除DPPH自由基,IC50為2.20 mg/mL[17],印度塊菌(Tuberindicum)多糖TIP-1清除DPPH自由基的IC50值為1.72 mg/mL[18]。DIP對DPPH自由基的清除效果極好,作用濃度為0.32 mg/mL時,清除率接近85%。同樣是抗氧化活性多肽,DIP的DPPH自由基的清除優(yōu)于牡蠣蛋白酶解多肽(IC50值為1.16 mg/mL)[19]。因此,在研究較為深入的真菌多糖、動物源多肽外,真菌抗氧化活性多肽也可以作為一種天然抗氧化物質(zhì),拓寬真菌抗氧化劑的提取范圍。

2.3 DIP的細(xì)胞毒性評價

DIP處理RAW264.7細(xì)胞24 h,經(jīng)MTT測試發(fā)現(xiàn),較低濃度DIP(3.13～50 μg/mL)對細(xì)胞未見明顯毒性,細(xì)胞存活率沒有出現(xiàn)顯著下降(圖4)。然而,繼續(xù)提高DIP的濃度,則會表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性。高濃度(100、200 μg/mL)的DIP則會抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖。基于以上分析,本文選用較低濃度的DIP(3.13、6.25、12.5、25、50 μg/mL)完成后續(xù)實驗。

圖4 DIP的細(xì)胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of DIP

2.4 DIP的免疫強化作用

2.4.1 中性紅吞噬活性 通過測定RAW264.7細(xì)胞對中性紅吞噬能力的改變來驗證DIP能否強化細(xì)胞吞噬能力,結(jié)果如圖5所示,DIP能夠顯著促進RAW 264.7細(xì)胞的中性紅吞噬能力。實驗選擇的最低濃度的DIP(3.13 μg/mL)處理后就能顯著提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬效果,較空白對照吞噬活性提高了近1倍。當(dāng)DIP濃度達(dá)到12.5 μg/mL,吞噬效果與空白對照呈現(xiàn)出極顯著的差異,已經(jīng)超過陽性對照LPS。進一步提高DIP濃度,吞噬效果呈現(xiàn)高位穩(wěn)定。

吞噬作用是巨噬細(xì)胞最具有代表性的免疫活動之一。通過中性紅吞噬實驗,我們發(fā)現(xiàn)DIP能夠較強的促進細(xì)胞的吞噬能力,說明DIP能夠提高先天免疫反應(yīng)。

圖5 DIP促進RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅Fig.5 Enhanced phagocytosis of neutral red of RAW264.7 cells by DIP注:與空白對照組比較,*表示差異顯著P<0.05, **表示差異極顯著P<0.01,圖6、圖7同。

2.4.2 DIP對信息遞質(zhì)NO分泌的影響 按照Griess試劑法的NO測定試劑盒的要求操作,建立回歸方程如下:Y=0.0322X+0.0968,R2=0.9962(X為所測標(biāo)準(zhǔn)品濃度,Y為所測吸光值),該回歸方程適用的吸光度范圍:0～3.3。

如圖6A所示,DIP處理后,NO濃度極顯著的上升。3.13 μg/mL的DIP使得NO濃度提高了近2.5倍。12.5 μg/mL DIP作用效果與陽性對照LPS相當(dāng)。進一步提高DIP濃度,NO濃度未出現(xiàn)明顯變化,在高位保持穩(wěn)定。DIP對RAW 264.7細(xì)胞分泌NO的作用十分迅速,32 h可達(dá)峰值,隨后急劇下降,陽性對照LPS作用較慢,48 h達(dá)到峰值。

NO是最具有代表性的生物活性信息遞質(zhì)之一,能介導(dǎo)機體免疫、炎癥等多種生理和病理過程?，F(xiàn)代研究表明,人體獲得性免疫、自身免疫疾病等都與NO的分泌密切相關(guān)[20]。就巨噬細(xì)胞而言,一方面,NO可以作為一種細(xì)胞毒性成分釋放,直接殺傷侵入有機體的微生物;另一方面,通過多種信號傳導(dǎo),NO能夠啟動級聯(lián)免疫反應(yīng),阻止腫瘤細(xì)胞繁殖與擴散。實驗中,DIP對NO分泌作用十分迅速,但是有效作用時間較短。DIP作為一種分子量小于3500 Da的多肽,較小的分子量使得其吸收相對迅速。作用時間較短,說明DIP的結(jié)構(gòu)可能不大穩(wěn)定,因此,如何提高真菌小分子活性多肽的穩(wěn)定性是今后研究的重點。

圖6 DIP促進RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO作用(A) 和RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO時間點(B)Fig.6 NO production(A)and its point in time(B)of stimulated RAW264.7 cells by DIP

2.4.3 DIP對RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響 按照ELISA試劑盒的要求,繪制出3種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線,依次建立回歸方程如下:TNF-α：Y=0.0024X+0.1284,R2=0.9923(X為所測標(biāo)準(zhǔn)品濃度,Y為所測吸光值,下同);IL-1β:Y=0.0151X+0.0846,R2=0.9981;IL-6:Y=0.0139X+0.0756,R2=0.9982。

如圖7，DIP對RAW264.7細(xì)胞3種細(xì)胞因子分泌的促進作用與其濃度直接相關(guān),低濃度作用較弱,中濃度明顯增強,高濃度高位穩(wěn)定的趨勢。12.5 μg/mL的DIP其促進作用與陽性對照相當(dāng),繼續(xù)增高DIP濃度,促進作用未見明顯增強。DIP對TNF-α及IL-6分泌促進作用較強。3.13 μg/mL的DIP就能使得TNF-α的分泌呈現(xiàn)出極顯著的差異(P<0.01)。

巨噬細(xì)胞通過分泌諸如細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì),以此來調(diào)控局部微環(huán)境,保護機體免受外界不良因素的侵害[21]。作為一種小分子多肽,DIP對于多肽類的細(xì)胞因子分泌的促進作用效果十分明顯,12.5 μg/mL的DIP能夠?qū)NF-α的含量提高一倍(圖7),已有學(xué)者報道400 μg/mL的靈芝孢子粉多糖對腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的促進率為50%[22],顯然,小分子多肽的促進效率更高,因此,如何分離提純小分子多肽值得進一步研究。

圖7 DIP促進RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子作用Fig.7 Effects of DIP stimulated cytokines secretion in RAW264.7 cells

2.4.4 DIP對RAW264.7細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)的影響 不同濃度DIP溶液作用于RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞膜蛋白Toll樣受體TLR2和TLR4表達(dá)量的變化情況如圖8。從圖8中可以看出,DIP處理后,RAW264.7細(xì)胞在TLR4和TLR9的表達(dá)量顯著升高,均呈現(xiàn)逐漸上升的變化趨勢,表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。DIP作用濃度后,TLR4的表達(dá)量峰值為17.09 ng/mL,TLR9的表達(dá)量峰值為15.98 ng/mL。

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞表面識別多種病原體及內(nèi)源性物質(zhì)的跨膜蛋白,能夠高效識別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子。巨噬細(xì)胞激活后,通過TLRs介導(dǎo)一系列免疫反應(yīng),如激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,促進NF-κB的核膜轉(zhuǎn)位,激活下游的抗凋亡基因(Bcl-2等)、抗腫瘤(TNF-α等)相關(guān)蛋白的表達(dá)[23]。

通過上述一系列實驗,發(fā)現(xiàn)DIP能夠促進Toll樣受體的表達(dá),活化巨噬細(xì)胞,增強其吞噬作用并促進其分泌細(xì)胞因子,對整個免疫過程都起到一定的強化作用。相關(guān)研究證實,激活巨噬細(xì)胞是先天和適應(yīng)性免疫一個關(guān)鍵事件,因此,后續(xù)實驗應(yīng)該集中于介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,以探索DIP精細(xì)的作用通路。

圖8 DIP對Toll樣受體表達(dá)的影響Fig.8 Effect of various concentrations of DIP on Toll like receptor expression

3 結(jié)論

本實驗分離獲得長裙竹蓀子實體多肽(DIP)并驗證其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。通過透析,分子排阻色譜和反相高效液相色譜分離可獲得純度較高的多肽DIP,DIP的得率為0.59%,粗蛋白含量70.35%。自由基清除實驗確認(rèn)DIP具有優(yōu)良的自由基清除活性,對DPPH自由基表現(xiàn)出極強的清除活性,IC50為0.15 mg/mL。對羥自由基和超氧陰離子自由基也具有良好的清除活性。進一步的功效實驗發(fā)現(xiàn),DIP能夠強化巨噬細(xì)胞的吞噬活性,12.5 μg/mL的DIP能夠提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性近200%。DIP能夠促進細(xì)胞因子的釋放,12.5 μg/mL的DIP能夠?qū)NF-α的含量提高1倍。進一步確定DIP可以提高Toll樣受體的活性,通過Toll受體的表達(dá),活化巨噬細(xì)胞,在先天和適應(yīng)性免疫中都能發(fā)揮作用。因此,DIP能夠增強機體免疫,可作為一種免疫活性肽加以開發(fā)利用,在保健品、藥品開發(fā)中具有一定的應(yīng)用前景。