DNA分子標(biāo)記技術(shù)在DUS測試中的應(yīng)用探討

韓瑞璽 張 晗 趙艷杰 馬瑩雪 李汝玉 唐 浩

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100125）

特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）測試（簡稱DUS測試）以形態(tài)標(biāo)記為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對品種的描述、三性判定和定義品種，是國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）確定的授予品種權(quán)的依據(jù)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定，又稱DNA指紋鑒定，是以一組遺傳標(biāo)記的基因型為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對品種的遺傳多樣性分析以及指紋信息的檢測。旨在探討DNA分子標(biāo)記技術(shù)在DUS測試中應(yīng)用的“是”與“非”，提出優(yōu)化DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的建議，以期在保證科學(xué)性的基礎(chǔ)上提高DUS測試效率，服務(wù)現(xiàn)代種業(yè)管理。

1 傳統(tǒng)特異性測試中面臨的現(xiàn)實(shí)困難

DUS測試是品種權(quán)授權(quán)的技術(shù)依據(jù)，其中特異性測試在界定權(quán)屬中尤為重要。特異性測試需要將待測品種與已知品種庫中所有的品種進(jìn)行表型性狀比較（通過數(shù)據(jù)庫或圖片等方法比對），與待測品種有明顯差異的品種不需要田間種植；不能確定與待測品種有明顯差異的，作為近似品種與待測品種進(jìn)行田間種植比較，通過表型性狀在品種間是否存在明顯差異進(jìn)行特異性評價。因此，構(gòu)建已知品種表型數(shù)據(jù)庫是做好特異性評價的基礎(chǔ)，也是世界各國的通行做法。而DUS測試實(shí)踐中，特異性評價仍然面臨一些困難：一是申請人提供的近似品種不準(zhǔn)確，甚至故意提供表型差異大的品種；二是申請人在技術(shù)問卷中提供的性狀描述不準(zhǔn)確，無法用于精確篩選近似品種；三是玉米、水稻、小麥等主要農(nóng)作物生態(tài)區(qū)較廣，不同測試分中心的表型數(shù)據(jù)直接比較時存在環(huán)境誤差。

2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在DUS測試中應(yīng)用的前提和模式

UPOV對DNA分子標(biāo)記技術(shù)在DUS測試中的應(yīng)用采取了積極而審慎的態(tài)度，UPOV技術(shù)委員會下成立了生化和分子標(biāo)記技術(shù)（BMT）工作組，專門研究DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用模式。在2010年UPOV先后發(fā)布了INF17（標(biāo)記的選擇及數(shù)據(jù)庫構(gòu)建）、INF18（分子標(biāo)記在DUS測試中的可能應(yīng)用）以及TGP15（生化和分子標(biāo)記在DUS測試中的應(yīng)用指南）文件。經(jīng)過多個成員多年的實(shí)踐，總結(jié)出兩種應(yīng)用模式。

2.1 利用與傳統(tǒng)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行性狀測試抗病、抗除草劑等性狀在田間觀測時，或觀測結(jié)果不穩(wěn)定，或需要特殊條件。對于這類性狀的測試，可采用分子標(biāo)記方法。但其應(yīng)用前提是分子標(biāo)記與性狀之間有可靠的連鎖關(guān)系，即有標(biāo)記則有抗性，無標(biāo)記則無抗性。測試實(shí)踐中，務(wù)必慎重評價連鎖的可靠性，因?yàn)橛袝r會出現(xiàn)反常案例。2018年在烏拉圭舉辦的BMT17次會議上，荷蘭專家報告了I2基因在番茄鐮刀菌抗性中的特殊情況，即所有含有I2基因的品種都具有鐮刀菌抗性，但某些品種不含I2基因也具有鐮刀菌抗性。

2.2 綜合利用表型距離和分子距離管理品種庫該模式將那些與待測品種的表型距離和分子距離低于一定閾值的已知品種作為近似品種與待測品種在田間相鄰種植，進(jìn)行特異性評價。其應(yīng)用前提在于確立分子距離與表型距離的關(guān)聯(lián)程度，確定一個安全的分子閾值，保證高于該分子距離閾值的已知品種與待測品種存在明顯差異（高于特異性判定的表型距離）從而無需進(jìn)行田間比較。該模式在法國、荷蘭等國的DUS測試領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用并取得了顯著成效。荷蘭、法國、韓國不僅構(gòu)建了覆蓋SSR和SNP標(biāo)記的品種DNA指紋庫，還將應(yīng)用范疇從DUS測試近似品種篩選，已知品種庫樣品更新時的復(fù)驗(yàn)，雜交公式的驗(yàn)證等拓展到其他領(lǐng)域，如種子純度檢測、品種權(quán)糾紛的輔助證據(jù)等。

3 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在我國DUS測試中的應(yīng)用及成效

2002年以來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心牽頭研制了玉米、水稻、小麥、辣椒等20多種作物DNA指紋鑒定標(biāo)準(zhǔn)，并逐步構(gòu)建了玉米、小麥、水稻、大豆等作物的DNA指紋數(shù)據(jù)庫。目前，在申請量大、已知品種數(shù)量多、生態(tài)適應(yīng)區(qū)廣的玉米、小麥、水稻、大豆、油菜等作物的DUS測試中，利用DNA指紋數(shù)據(jù)管理已知品種庫，輔助篩選近似品種，取得了明顯成效。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試（濟(jì)南）分中心建立了覆蓋全國小麥產(chǎn)區(qū)已知品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，對2013-2017年總計(jì)319份小麥待測品種，利用“表型距離+分子距離”結(jié)合的方式篩選近似品種，通過田間種植評價，共檢測出特異性不合格品種38份，占全部申請品種總數(shù)的11.9%，有力地打擊了修飾育種或者剽竊品種。此外，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試中心還組織針對集中測試、申請量較大的大白菜、辣椒、番茄、西瓜、甜瓜等作物構(gòu)建DNA指紋庫，用于近似品種篩選、真實(shí)性鑒定等工作。

4 正確認(rèn)識DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用中的幾個問題

我國以及其他UPOV成員的DUS測試實(shí)踐表明，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

4.1 DUS測試是品種確權(quán)的依據(jù)，DNA分子標(biāo)記方法不是從科學(xué)性的角度看，性狀是基因與基因互作、基因與環(huán)境互作的結(jié)果。DUS測試不僅包含了這些互作，還綜合了基因表達(dá)時空特性，在不同生育期進(jìn)行觀測并做出科學(xué)的判定。盡管ISTA、ISF和OECD等國際組織鼓勵DNA分子方法在品種鑒定中的應(yīng)用，但與基于表型性狀的品種鑒定方法有根本不同。DUS測試對植物群體進(jìn)行定義，判定一個植物群體是否是品種（具備一致性和穩(wěn)定性）、是否有別于其他品種（具備特異性，即可區(qū)別性），主要針對未知的植物群體；基于DNA分子方法的品種鑒定是對已定義為品種的代表性種子批進(jìn)行符合性檢驗(yàn)，判斷是否相符于品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品，針對已定義的品種標(biāo)準(zhǔn)樣品。由于有限的分子標(biāo)記數(shù)量和表型性狀表達(dá)的復(fù)雜性，即使種子批樣品基因型與標(biāo)準(zhǔn)樣品相符，也并不意味著二者表型性狀完全一致。

4.2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在DUS測試中應(yīng)用的主要目的并非加快授權(quán)2016年實(shí)施的新修訂《種子法》規(guī)定，申請品種權(quán)保護(hù)、品種審定和品種登記的品種均應(yīng)符合特異性、一致性和穩(wěn)定性的要求。新形勢下DUS測試量快速增加，2017年已突破1萬件。為此，有人提議用DNA分子標(biāo)記檢測的方法替代DUS測試以加快授權(quán)。DUS測試是基于表型性狀的測試，由于表型性狀表達(dá)的復(fù)雜性，分子距離并不等同于表型距離?；诜肿泳嚯x的特異性測試并不可靠。另外，DUS測試還包括對一致性和穩(wěn)定性的測試，基于分子性狀的一致性和特異性評價方法不僅存在嚴(yán)謹(jǐn)性的問題，其測試成本和效率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法。正是由于上述原因，UPOV體系內(nèi) DNA分子技術(shù)應(yīng)用的主要目的是管理已知品種庫，以便在特異性評價時盡可能多地排除那些需要田間種植的品種，從而降低人力和物力投入。

4.3 遺傳相似度高低與表型距離無嚴(yán)格線性關(guān)系以濟(jì)南小麥DUS測試為例，對遺傳相似度90%～95%的15對品種進(jìn)行田間種植，7對品種間無明顯表型差異（不具備特異性），8對品種間有明顯表型差異（具備特異性）；遺傳相似度95%～100%的35對品種中，26對品種不具備特異性，9對具備特異性。此外，遺傳相似度的高低與差異性狀數(shù)量多少也無嚴(yán)格線性關(guān)系（圖1）。科技發(fā)展中心近年來接到因分子位點(diǎn)差異數(shù)少于審定要求，育種者主動提出復(fù)檢的田間種植比對鑒定結(jié)果也表明，分子檢測判定“極近似”或“疑同”品種，半數(shù)以上有明顯性狀差異。

圖1 具備特異性的樣品中，待測品種與近似品種的遺傳相似度與差異性狀比較

4.4 DNA分子標(biāo)記技術(shù)不能用于一致性評價由于基因型和表型的對應(yīng)關(guān)系尚未解決，現(xiàn)行技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)所用的有限的標(biāo)記無法關(guān)聯(lián)表型性狀，因此只能反映品種內(nèi)個體間在這些位點(diǎn)上的一致程度，并非表型上的一致性。加之品種內(nèi)個體之間在遺傳背景上比較接近，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)在區(qū)分異型株方面顯得無力。由于表型調(diào)控的復(fù)雜性，不僅涉及基因型，還涉及基因與基因互作、基因與環(huán)境的互作，即使增加分子標(biāo)記也無法判定品種一致性。在2018年BMT17次會議上，以往呼聲最為強(qiáng)烈的美國代表也理性地回歸到UPOV的應(yīng)用模式。

5 建議

UPOV成員和我國的實(shí)踐表明，DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以在DUS測試中有用武之地。關(guān)鍵取決于如何應(yīng)用，要達(dá)到的目標(biāo)是什么。為進(jìn)一步提高DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用成效，提出以下建議。

5.1 考慮作物類型對于申請量大、生態(tài)區(qū)廣、已知品種數(shù)量多的作物，DNA分子標(biāo)記技術(shù)作用非常明顯。但對于存在芽變（部分果樹）、回交（部分水稻等）或高世代分離選種等育種方式的作物，后代與親本遺傳背景非常接近，DNA分子標(biāo)記技術(shù)作用有限。

5.2 標(biāo)記方法的選擇2018年在BMT17次會議上，與會代表對INF17和TGP15文件進(jìn)行了修訂，新版本充分考慮了新技術(shù)，例如GBS（Genotyping by sequencing）等基于測序的基因分型方法。選擇SSR、SNP還是GBS應(yīng)綜合考慮標(biāo)記的可獲取性、技術(shù)經(jīng)驗(yàn)、成本、數(shù)據(jù)共享性等多個因素。從UPOV成員的實(shí)踐看，一些標(biāo)記方法可能在同一個實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性相對較好，在不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性會因檢測平臺不同而不同，標(biāo)記選擇應(yīng)以滿足需求為評價標(biāo)準(zhǔn)。

5.3 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的有效性至關(guān)重要DNA分子標(biāo)準(zhǔn)的核心是一套分子標(biāo)記位點(diǎn)，它是在研制時基于一組（小樣本）表型有差異的品種確定，用于已知品種庫（大樣本）管理。因此，分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研制時的品種樣本數(shù)量、表型多樣性以及標(biāo)記的評價決定了分子標(biāo)準(zhǔn)最終的有效性。

5.4 加強(qiáng)合作從國內(nèi)水平看，DNA分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)整合技術(shù)實(shí)力強(qiáng)的單位，聯(lián)合品種資源、品種測試單位共同研制，一種作物只出一個高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)進(jìn)行有效性驗(yàn)證；一種作物只構(gòu)建一個統(tǒng)一共享的品種指紋數(shù)據(jù)庫，用于品種測試和品種管理。國際方面，荷蘭、韓國、法國等都希望能夠加強(qiáng)合作，共同研制一批國際分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，克服當(dāng)前不同的國家因采取不同的分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致同一品種的指紋數(shù)據(jù)無法比對的困難。