脂多糖誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞激活、焦亡及耐受機制研究進(jìn)展*

譚定勇，秦凡博 綜述，程 瑤，龔建平△ 審校

(1.重慶市萬州區(qū)人民醫(yī)院普外科 404000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

Kupffer細(xì)胞是一類定植于肝臟中的巨噬細(xì)胞，是人體巨噬細(xì)胞中最大的一個群體，它的主要功能為吞噬病原菌、微生物、壞死細(xì)胞碎片及作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用。由于肝臟解剖位置的特殊性，使得其長期暴露于腸道來源的各種病原微生物環(huán)境中，因此，Kupffer細(xì)胞便組成了肝臟在面對各種病原微生物時的第一道屏障，因為其特殊的功能使得它在先天免疫系統(tǒng)及獲得性免疫系統(tǒng)中占據(jù)著重要的地位[1]。Kupffer細(xì)胞中可以表達(dá)多種模式識別受體(PRRs)，如表達(dá)在細(xì)胞膜上的Toll樣受體(TLRs)，細(xì)胞質(zhì)中的Nod樣受體(NLRs)等，可以對細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外各種病原相關(guān)模式分子及危險相關(guān)模式分子進(jìn)行識別，進(jìn)而被激活。革蘭陰性菌的細(xì)胞壁脂多糖(LPS)為內(nèi)毒素的主要構(gòu)成，它是眾多可以激活Kupffer細(xì)胞使其發(fā)揮特定功能的物質(zhì)中最經(jīng)典的一類，LPS既往對于Kupffer細(xì)胞激活的研究多是聚焦于其依賴的TLRs途徑，近年來在關(guān)于巨噬細(xì)胞的研究上，發(fā)現(xiàn)了另外一種非TLRs依賴的信號通路，而這條信號通路的激活依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11(caspase-11)并會伴隨炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的釋放，細(xì)胞本身經(jīng)此途徑激活后則會發(fā)生一種炎癥形式的細(xì)胞死亡即細(xì)胞焦亡。Kupffer細(xì)胞的激活與內(nèi)毒素耐受的現(xiàn)象有很大聯(lián)系，因為內(nèi)毒素耐受依賴于各種調(diào)節(jié)因素對Kupffer細(xì)胞激活通路上各個環(huán)節(jié)的精密調(diào)控，這其中包括了許多負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)改變，以及近年來廣受關(guān)注的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)泛素化修飾和非編碼RNA在其中的作用。

1 LPS誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞激活的信號通路

1.1細(xì)胞外LPS激活Kupffer細(xì)胞的信號通路 Kupffer細(xì)胞可以被多種刺激物激活，如革蘭陰性菌的細(xì)胞壁LPS、細(xì)菌及真菌的β葡聚糖、補體因子C3a和C5a等,激活的Kupffer能夠上調(diào)多種炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及干擾素-γ(INF-γ)等[2]。在這些眾多的激活Kupffer細(xì)胞的刺激物中，LPS是最為經(jīng)典且研究得最深入的一種，LPS主要通過作用于TLRs家族中的TLR4起到激活細(xì)胞的作用。Toll蛋白最早是在20世紀(jì)90年代果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種參與天然免疫反應(yīng)的蛋白，與果蠅類似，人類細(xì)胞中的TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，它可以廣泛識別各種病原體相關(guān)模式(PAMPs)，如細(xì)菌、病毒的DNA、RNA及真菌等，是機體天然免疫的重要組成成分。在人類細(xì)胞中，被證實的TLRs有10種，肝臟中Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞及肝實質(zhì)細(xì)胞等均大量表達(dá)TLRs。LPS引起的TLR4通路的激活方式目前大多認(rèn)為是以下過程：血漿中的脂質(zhì)結(jié)合蛋白(lipid-binding protein,LBP)與LPS相結(jié)合，將LPS運輸?shù)脚c錨定在脂質(zhì)膜上脂筏區(qū)域中的CD14相結(jié)合，CD14將LPS轉(zhuǎn)運并與髓樣分化因子2(myeloid differentiation factor 2,MD2)相結(jié)合，最終形成TLR4/MD2復(fù)合物的二聚體，二聚體的形成是炎癥開始的第一步[3]。最近，LI等[4]揭示了一種影響TLR4活性的新機制，T3JAM(TRAF3-interacting JNK-activating modulator，T3JAM)可以作為一種分子鉗來“收緊”TLR4，促進(jìn)其向脂筏區(qū)域易位，最終增強巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。LPS通過與TLR4和MD-2作用形成的復(fù)合體隨后會活化髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)依賴的下游通路或形成TLR4的內(nèi)吞體。一方面，MyD88被募集后進(jìn)一步招募白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK1)、IRAK2、TNF受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)等蛋白形成蛋白復(fù)合物，最終這個蛋白復(fù)合物可以分別激活核因子-κB(NF-κB)及JNK/p38 MAPK信號通路；另一方面，除了依賴于MyD88激活NF-κB和JNK/p38 MAPK通路外，LPS被轉(zhuǎn)位進(jìn)入TLR4的內(nèi)吞體內(nèi)，隨后招募TRIF、TRAF3及其他蛋白，使得INF調(diào)節(jié)因子IRF3發(fā)生磷酸化，最終上調(diào)(INF-Ⅰ)的表達(dá)[5]。

1.2細(xì)胞內(nèi)LPS激活Kupffer細(xì)胞的信號通路 Kupffer細(xì)胞雖為人體主要的巨噬細(xì)胞群體，但專門針對細(xì)胞內(nèi)LPS激活Kupffer細(xì)胞的信號通路相關(guān)研究仍較少，但一些對于LPS感染巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究卻能提示Kupffer細(xì)胞中也可能存在類似激活途徑。既往很長一段時間研究者們認(rèn)為LPS只能在細(xì)胞外作用于TLRs激活巨噬細(xì)胞，然而，KAYAGAKI等[6]最早發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠巨噬細(xì)胞感染某些革蘭陰性菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌后，會出現(xiàn)一種依賴于caspase-11的炎癥因子釋放，而且caspase-11可以殺死巨噬細(xì)胞內(nèi)從囊泡逃逸出的這些細(xì)菌。這些現(xiàn)象說明了這些革蘭陰性菌可能通過某個相同的病原體相關(guān)模式分子能夠激活caspase-11。caspase-11在正常狀態(tài)下的細(xì)胞中表達(dá)常較低，但可以使用不同的TLRs激動劑誘導(dǎo)caspase-11在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，因此，HAGAR等[7]和KAYAGAKI等[8]用不同的TLRs激動劑預(yù)處理Kupffer細(xì)胞后，使用電穿孔的方法，將革蘭陰性菌共有的成分LPS轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)caspase-11被激活，此外，KAYAGAKI等[8]還發(fā)現(xiàn)了是LPS的脂質(zhì)A成分作用于caspase-11的CARD結(jié)構(gòu)域才可以將其激活。因此，這兩個獨立的實驗均證明了細(xì)胞內(nèi)的LPS依賴于caspase-11可以激活Kupffer細(xì)胞。另外，在LPS是如何進(jìn)入Kupffer細(xì)胞這個問題上，又有許多學(xué)者展開了研究。有觀點認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸結(jié)合蛋白可以通過對包含革蘭陰性菌的囊泡及包含LPS的外膜囊泡(out-membrane vesicles,OMVs)進(jìn)行裂解使LPS在細(xì)胞內(nèi)定位[9]。最近，DENG等[10]發(fā)現(xiàn)在膿毒血癥中，高遷移率族蛋白1(HMGB1)可以結(jié)合LPS通過晚期糖基化終產(chǎn)物(RAGE)受體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后通過溶酶體的作用使LPS在細(xì)胞質(zhì)中釋放出來[10]。除此之外，還有研究者認(rèn)為LPS進(jìn)入細(xì)胞可能還與LBP有關(guān)，因為他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞外LPS濃度升高時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LPS-LBP復(fù)合物也會隨之升高，但LBP介導(dǎo)LPS進(jìn)入細(xì)胞的具體機制仍有待探索[11]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的LPS或革蘭陰性菌激活caspase-11后，會產(chǎn)生兩方面的效應(yīng)：一方面，活化的caspase-11可以介導(dǎo)Kupffer細(xì)胞發(fā)生炎癥的程序性死亡，即細(xì)胞焦亡；另一方面，它可以通過激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白-凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(NLRP3-ASC)復(fù)合體激活caspase-1，從而使炎癥因子IL-1β、IL-18成熟釋放。由于既往的關(guān)于NLRP3經(jīng)典炎癥小體的激活與此激活途徑有很大差別，故也將此條途徑稱之為非經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活通路?，F(xiàn)普遍認(rèn)為由caspase-11激活引起的鉀離子外流是最關(guān)鍵的因素[12]。YANG等[13]發(fā)現(xiàn)，活化的caspase-11可以通過切割細(xì)胞膜上的pannexin-1蛋白使鉀離子外流及ATP釋放，鉀離子外流使NLRP3/ASC/caspase-1通路激活，而ATP釋放則與焦亡相關(guān)。除鉀離子外，溶酶體中的組織蛋白酶B的釋放也與NLRP3非經(jīng)典炎癥小體通路的激活相關(guān)， CHEN等[14]發(fā)現(xiàn)在Kupffer細(xì)胞中，LPS可能會使溶酶體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞，使其中的組織蛋白酶B從中釋放，而組織蛋白酶B的釋放使caspase-11的激活增強，從而通過上述途徑激活非經(jīng)典NLRP3炎癥小體，但LPS是如何影響溶酶體膜的結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步探索。

2 細(xì)胞內(nèi)LPS誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞焦亡

細(xì)胞內(nèi)LPS通過上述信號通路將巨噬細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞激活之后，除了能夠分泌多種炎癥介質(zhì)參與促炎或抗炎反應(yīng)外，這些細(xì)胞內(nèi)LPS還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生一種炎癥形式的程序性死亡，即細(xì)胞焦亡。焦亡分為2條途徑：經(jīng)典焦亡途徑與非經(jīng)典焦亡途徑，而細(xì)胞內(nèi)的LPS或革蘭陰性菌誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞焦亡屬于非經(jīng)典焦亡途徑。以往的研究者不清楚caspase-11(在人類細(xì)胞中則為caspase-4/5)的下游關(guān)鍵分子機制，以至于無法很好解釋LPS介導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞死亡。KAYAGAKI等[15]和SHI等[16]通過不同的方法找到了焦亡下游的關(guān)鍵分子Gasdermin D(GSDMD)。KAYAGAKI等[15]通過小鼠基因的大量變異去篩選與caspase-11介導(dǎo)的焦亡相關(guān)的基因；SHI等[16]通過基因編輯技術(shù)找到了caspase-1和caspase-11介導(dǎo)的焦亡下游的共同分子。他們發(fā)現(xiàn)，被激活的caspase-11會去切割這個分子，從而使該分子的N端從自我抑制的C端中釋放出來，釋放出的N端是細(xì)胞發(fā)生焦亡的關(guān)鍵。隨后，DING等[17]又說明了N端導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因[17]，他們發(fā)現(xiàn)被切割下來的N端可以結(jié)合脂質(zhì)膜并能在細(xì)胞膜上形成由16個單元圍成的直徑約為10～14 nm的孔洞，因滲透壓的作用從而引起細(xì)胞腫脹死亡。除GSDMD介導(dǎo)的焦亡外，YANG等[13]發(fā)現(xiàn)，pannexin-1和P2X7對于Kupffer細(xì)胞的焦亡也至關(guān)重要，因為在缺乏這兩個蛋白時細(xì)胞內(nèi)的LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡程度會減弱，并且野生型小鼠相較于這兩個基因被敲除后的小鼠更容易在LPS的刺激下死亡，機制上解釋為，激活的caspase-11切割pannexin-1使ATP釋放，ATP的釋放作用于細(xì)胞膜上的P2X7，從而使非選擇性陽離子通道開放，誘發(fā)細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡作為一種炎癥形式細(xì)胞死亡的方式，可以通過殺滅感染細(xì)胞及釋放炎癥因子兩個手段達(dá)到使感染局限以抵抗感染的作用，除此之外，通過細(xì)胞內(nèi)LPS激活非經(jīng)典NLRP3炎癥小體通路也能使炎癥因子的釋放增多。現(xiàn)在認(rèn)為焦亡主要發(fā)生在一些具有吞噬功能的細(xì)胞中，比如Kupffer細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[18]，而Kupffer細(xì)胞作為人體巨噬細(xì)胞中最大的一個群體，專門針對Kupffer細(xì)胞的焦亡或是炎癥小體通路的研究卻相對較少。因此，若進(jìn)一步理解焦亡和炎癥小體在Kupffer細(xì)胞中的作用，可能會為感染相關(guān)的疾病如膿毒血癥、內(nèi)毒素休克等提供新的治療靶點。

3 Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受機制的研究進(jìn)展

3.1內(nèi)毒素耐受概念及TLRs通路上的負(fù)性調(diào)控因子 內(nèi)毒素耐受指的是，當(dāng)預(yù)先給予小劑量的LPS刺激之后，在隨后的大劑量LPS作用下，機體會表現(xiàn)出較低的炎性反應(yīng)或是不表現(xiàn)出炎性反應(yīng)的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象與許多膿毒血癥患者感染的后期發(fā)生免疫麻痹在原理上有許多的相似之處。肝臟長期暴露在來源于腸道微生物刺激的環(huán)境下，卻不表現(xiàn)明顯炎癥，其中，Kupffer細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。內(nèi)毒素耐受時可以發(fā)生TLRs受體的下調(diào)、信號分子的改變、轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)性調(diào)控及染色質(zhì)的組蛋白修飾[19]等。在TLR4信號通路的各個環(huán)節(jié)上，內(nèi)毒素耐受會使TLR4表達(dá)下調(diào)、TLR4對MYD88及TRIF招募的降低、IRAK1/4的活性降低及通過形成無活性的p50二聚體影響NF-κB活性[20-21]。除此之外，還包括一些作用于此條通路中負(fù)性調(diào)節(jié)因子的上調(diào)，現(xiàn)已被證實的包括Pellinon3負(fù)性調(diào)控TLR4/TLR2信號通路、IRAK-M抑制IRAK1/IRAK4激酶、SHIP1抑制JNK和p38磷酸化從而抑制MAPK信號通路、SCOS1負(fù)調(diào)控TLR4/MYD88通路、Twist-2阻斷NF-κB促炎癥轉(zhuǎn)錄等[22-26]。

3.2TRAF3的泛素化修飾在Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受中的作用 TRAF3為腫瘤壞死因子受體家族成員之一，其生物學(xué)功能依賴于它的K48泛素化降解及K63自身泛素化激活，由于它在內(nèi)毒素耐受中可以影響JNK/p38 MAPK通路及TRIF通路[27]，因此對于TRAF3泛素化修飾在內(nèi)毒素耐受中相關(guān)的研究近年來有不少的報道。LI等[28]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素耐受時MAPK通路發(fā)生了重編程，機制上是通過Pellinon1介導(dǎo)的cIAP2的K63泛素化抑制及TRAF3的K48泛素化降解的抑制來實現(xiàn)，并且還在膽管炎患者體內(nèi)也驗證了Pellinon1的上調(diào)及TRAF3的下調(diào)的現(xiàn)象。同一個團隊中的WEN等[29]也發(fā)現(xiàn)了在Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受時USP25這種專門針對TRAF3的去泛素化酶表達(dá)會出現(xiàn)上調(diào)，然后通過抑制TRAF3的K48泛素化連接從而抑制其降解，最終抑制MAPK通路實現(xiàn)內(nèi)毒素耐受。

3.3非編碼RNA對TLRs信號通路的調(diào)控在Kuffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受中的作用

3.3.1微RNA(microRNA,miRNA)對Kuffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受的調(diào)控 miRNA為一類長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA，可以與mRNA非翻譯區(qū)的3′端的多個位點結(jié)合，起到對mRNA轉(zhuǎn)錄后的負(fù)性調(diào)控作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA對于TLRs信號通路的調(diào)控在內(nèi)毒素耐受中十分重要。如miRNA-98(miR-98)可以抑制IL-10的分泌，而在Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受時，miR-98下調(diào)，從而使對IL-10翻譯的抑制減弱[30]。miR-221、miR-579和miR-125b均可以對TNF-α進(jìn)行抑制，其中miR-221促進(jìn)TNF-α降解，miR-579和miR-125b抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄[31]。另有研究表明miR-146α和miR-155可以同時通過染色質(zhì)的三維空間對同一個基因共同定位，用相同的轉(zhuǎn)錄機制和相似的對Histone3甲基化譜的作用共同調(diào)節(jié)內(nèi)毒素耐受的形成[32]。SEELEY等[33]通過對免疫耐受相關(guān)的miRNA的篩查發(fā)現(xiàn)，miR-221和miR-222可以通過依賴于SWI/SNF和STAT介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑，調(diào)節(jié)Brg1基因，使得一系列炎癥因子相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄沉默，從而達(dá)到免疫耐受的狀態(tài)，且膿毒癥患者免疫麻痹的發(fā)生也被證實伴隨著miR-221/222的表達(dá)升高。

3.3.2長鏈非編碼RNA(LncRNA)對內(nèi)毒素耐受的調(diào)控 LncRNA是一類長度超過200個核苷酸不編碼蛋白的調(diào)節(jié)RNA，與miRNA多在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的專一機制有所區(qū)別，LncRNA可以在多個水平上用多種機制參與生理病理過程的調(diào)控。LncRNA的表達(dá)譜在LPS激活TLRs通路時發(fā)生了很大的變化。DU等[34]發(fā)現(xiàn)，LncRNA Mirt2可以在LPS刺激后的Kupffer細(xì)胞中起到負(fù)性調(diào)節(jié)TLR信號通路的作用，它是通過抑制TRAF6的K63泛素化從而影響NF-κB及JNK/p38 MAPK通路，抑制炎性反應(yīng)。在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，LncRNA MALAT1可以與NF-κB在核內(nèi)作用，抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)水平[35]。除此之外，最近也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路的耐受可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的LncRNA PCGEM1、LncRNA HOTTIP的抑制及LncRNA snaR的上調(diào)，但這些LncRNA在免疫耐受狀態(tài)下的具體作用還有待探索[36]?？傊?，有許多LncRNA的變化都可以調(diào)節(jié)TLRs信號通路的重編程，但大多數(shù)LncRNA的表達(dá)及它們的功能在內(nèi)毒素耐受中的作用尚未得到驗證，可以預(yù)見，這些LncRNA在Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受時的作用及機制也將成為以后的研究熱點。

4 總結(jié)與展望

Kupffer細(xì)胞其數(shù)量龐大且功能復(fù)雜，LPS刺激Kupffer細(xì)胞后可以通過多種信號通路將其激活，這些被激活的信號通路的改變對于Kupffer細(xì)胞的焦亡及Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受有著十分重要的作用。細(xì)胞焦亡的相關(guān)研究雖然大多數(shù)并沒有專門集中在Kupffer細(xì)胞當(dāng)中，但是也可以從其他類型的細(xì)胞如單核Kupffer細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中尋找有關(guān)于Kupffer細(xì)胞焦亡的線索。Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受的研究在蛋白質(zhì)翻譯后修飾及非編碼RNA等領(lǐng)域取得一些進(jìn)展?？傊?，對于Kupffer細(xì)胞激活、焦亡及內(nèi)毒素耐受機制的研究，將會為解決某些臨床問題如膿毒癥、肝臟移植免疫耐受及肝臟腫瘤等提供新的理論支持。