新孢子蟲(chóng)GRA6表達(dá)、定位及對(duì)小鼠免疫效力的初步分析

邢 明，劉 晶，王 輝，郝 攀，劉 群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部人畜共患病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

新孢子蟲(chóng)GRA6表達(dá)、定位及對(duì)小鼠免疫效力的初步分析

邢 明，劉 晶，王 輝，郝 攀，劉 群*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部人畜共患病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

頂復(fù)亞門(mén)原蟲(chóng)在其侵入宿主細(xì)胞及其納蟲(chóng)空泡的形成過(guò)程中，有多種蛋白質(zhì)發(fā)揮著重要的作用，其中致密顆粒蛋白在納蟲(chóng)空泡的形成和修飾過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。作者從新孢子蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增致密顆粒蛋白GRA6基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-NcGRA6，表達(dá)、純化蛋白質(zhì)，制備鼠源多抗，利用IFA對(duì)NcGRA6進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，顯示其定位于納蟲(chóng)空泡的網(wǎng)狀系統(tǒng)。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GRA6，分別用真核質(zhì)粒和重組蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠，給三免后小鼠腹腔接種2×106新孢子蟲(chóng)速殖子，觀察小鼠臨床變化。每次免疫前，采血檢測(cè)抗體水平；攻蟲(chóng)后第30天，處死小鼠，利用RT-PCR檢測(cè)小鼠腦內(nèi)荷蟲(chóng)量，結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒和純化蛋白免疫后均對(duì)小鼠提供了較好的免疫保護(hù)，與未免疫的對(duì)照組小鼠相比差異顯著(P<0.05)。

新孢子蟲(chóng)；GRA6；定位；免疫原性

新孢子蟲(chóng)病(Neosporosis)是由(犬)新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)引起的多種動(dòng)物共患寄生原蟲(chóng)病，呈世界性分布。新孢子蟲(chóng)是一種嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，宿主范圍廣泛，包括牛、馬、豬、犬、貓等多種家養(yǎng)動(dòng)物，鹿、狐貍、熊、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等多種野生動(dòng)物也都可以感染[1-2]。新孢子蟲(chóng)病主要引起宿主的肌肉神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱胎等一系列繁殖障礙，對(duì)牛的危害最大，已在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)奶牛新孢子蟲(chóng)感染嚴(yán)重，血清陽(yáng)性率達(dá)到20%～25%，并證實(shí)新孢子蟲(chóng)感染與牛流產(chǎn)密切相關(guān)，是奶牛流產(chǎn)的重要原因之一[3-4]。迄今為止，還沒(méi)有篩選到對(duì)新孢子蟲(chóng)感染有特效的藥物，且由于成年動(dòng)物的新孢子蟲(chóng)感染多為隱性感染，牛感染后至流產(chǎn)才被發(fā)現(xiàn)，難以掌握用藥時(shí)機(jī)，所以有關(guān)藥物治療的報(bào)道很少。20世紀(jì)90年代，曾有滅活苗在某些國(guó)家和地區(qū)試用，但臨床效果不確實(shí)，沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。目前對(duì)新孢子蟲(chóng)的控制是在有效檢測(cè)的基礎(chǔ)上，淘汰感染牛，凈化牛群，但這種方法會(huì)導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失，也難以推廣，因此急需篩選和研制高效疫苗來(lái)防控新孢子蟲(chóng)病。

頂復(fù)亞門(mén)原蟲(chóng)在入侵宿主細(xì)胞時(shí)，有三類(lèi)重要分泌蛋白，包括棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白(dense granule protein)和微線體蛋白[3]。分泌蛋白在蟲(chóng)體入侵、繁殖、發(fā)育以及釋放過(guò)程中發(fā)揮著主要作用，其中致密顆粒蛋白的功能主要是對(duì)納蟲(chóng)空泡進(jìn)行修飾、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸以及與納蟲(chóng)空泡內(nèi)蟲(chóng)體的同步分裂有關(guān)[5]。新孢子蟲(chóng)作為頂復(fù)亞門(mén)原蟲(chóng)的新成員，對(duì)其的研究相對(duì)較少。迄今，已見(jiàn)于報(bào)道的新孢子蟲(chóng)致密顆粒蛋白有6種，分別是NcGRA1[6]、NcGRA2[7]、NcGRA6(又名NcDG1)[8]、NcGRA7(又名NcDG2或Nc-p33)[9]、NcGRA14[10]和NcNTP (NTPase)[11]，但是新孢子蟲(chóng)基因組中存在著與弓形蟲(chóng)其他致密顆粒蛋白同源性很高的未命名基因。

對(duì)NcGRA6已知的信息包括：未成熟GRA6蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為37 ku，成熟GRA6相對(duì)分子質(zhì)量約為19 ku；與弓形蟲(chóng)GRA6氨基酸序列相似性為34%，在其C末端存在疏水區(qū)，推測(cè)與新孢子蟲(chóng)納蟲(chóng)空泡膜的形成有關(guān)系，但是是否可以抵御新孢子蟲(chóng)速殖子的入侵有待于深入研究。

本研究從新孢子蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增GRA6基因，分別構(gòu)建pGEX-GRA6原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體pcDNA-GRA6，進(jìn)行NcGRA6的表達(dá)、定位、鑒定及其免疫保護(hù)效力的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero和HEK293T細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室傳代和保存。

新孢子蟲(chóng)Nc1株，經(jīng)Dubey 授權(quán)，日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)國(guó)家原蟲(chóng)病研究所玄學(xué)南教授饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代、保存。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c雌鼠(6周齡)，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 載體和菌株

pGEX-6p-1原核表達(dá)載體、pcDNA3.1(+)載體；pEASY-T1-Simple克隆試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞E.coliTrans1-T1和Transetta，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 其他試劑和儀器

DNA快速連接試劑盒購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司； GST融合蛋白純化柱及填料購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司； FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG等二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；其他常用試劑均購(gòu)自北京吉普騰生物技術(shù)有限公司。

所用儀器：德國(guó)Biometra公司Tgradient PCR 儀、美國(guó)AlphaImagerTM2200，Alpha Innotech 公司α-凝膠成像儀、美國(guó)BIO-RAD POWER/PAC 1000電泳儀與電泳成套設(shè)備等。

1.4 方法

1.4.1 NcGRA6的生物信息學(xué)分析 將GRA6編碼序列提交Sanger 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.Sanger.ac.uk)進(jìn)行序列比對(duì)，分析內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及在染色體上的位置；利用蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù) ExPASY(http://ca.expasy.org)中Proteomic在線分析工具 protparam(http://ca.expasy.org/tools/protparam.htmL)分析GRA6氨基酸序列的等電點(diǎn)、穩(wěn)定系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量；利用ExPASY數(shù)據(jù)庫(kù)中Protscale 在線軟件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale)對(duì)GRA6氨基酸序列的親水性和疏水性進(jìn)行分析；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)對(duì)GRA6的信號(hào)肽和跨膜區(qū)進(jìn)行分析；利用DNAStar軟件中Protean 分析工具對(duì)GRA6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原性進(jìn)行分析。

1.4.2NcGRA6基因擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建 以新孢子蟲(chóng)基因組DNA為模板，擴(kuò)增NcGRA6基因，引物序列見(jiàn)表1。在GRA6原核表達(dá)載體上下游引物引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)注)，在真核表達(dá)質(zhì)粒上游引物加入HindⅢ酶切位點(diǎn)和Kozark序列，下游引物加his標(biāo)簽和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

表1 引物設(shè)計(jì)

Table 1 Primer design

名稱(chēng)Name序列Sequence酶切位點(diǎn)EnzymecuttingsitepGEX-GRA6-F15'-cgGAATTCGCCGATCCGGTTGAATCCG-3'EcoRⅠpGEX-GRA6-R15'-ccgCTCGAGCTATTTTTCCTCCCCGCCG-3'XhoⅠpcDNA-GRA6-F35'-gccAAGCTTGCCACCATG-3'HindⅢpcDNA-GRA6-R35'-gcTCTAGATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3'XbaⅠ

PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性10 min； 94 ℃變性40 s； 60 ℃退火1 min； 72 ℃復(fù)性1 min，共3個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用低融點(diǎn)瓊脂糖法回收。

分別用EcoRⅠ/XhoⅠ或HindⅢ/XbaⅠ雙酶切，電泳回收GRA6與相應(yīng)載體，然后用Faster linker連接酶置于37 ℃連接30 min，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pGEX-GRA6和pcDNA-GRA6質(zhì)粒。

1.4.3 重組蛋白質(zhì)表達(dá)及鑒定 將含重組質(zhì)粒pGEX-GRA6工程菌于37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1～6 h，收集菌體。12% SDS-PAGE電泳對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

用親和層析法純化GRA6蛋白：將表達(dá)菌超聲裂解，經(jīng)Sepharose 4B柱洗脫、收集蛋白質(zhì)。用純化的蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)血清抗體滴度。

將純化蛋白質(zhì)于100 V轉(zhuǎn)膜60 min，以其多克隆抗體作為一抗(1∶200)，羊抗鼠IgG-HRP為二抗(1∶5 000)進(jìn)行Western blot鑒定。

1.4.4 NcGRA6亞細(xì)胞定位 以制備的鼠源多抗為一抗(1∶100稀釋)、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG (1∶100)為二抗，對(duì)細(xì)胞內(nèi)新孢子蟲(chóng)進(jìn)行IFA檢測(cè)，共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.5 真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定 將構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GRA6轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以anti-his抗體為一抗，采用IFA及Western blot方法，檢測(cè)真核細(xì)胞內(nèi)GRA6的表達(dá)情況。

1.4.6 NcGRA6免疫BALB/c小鼠后對(duì)新孢子蟲(chóng)感染的保護(hù)力 分別用rNcGRA6純化蛋白和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GRA6免疫BALB/c小鼠。在第三次免疫后一周每只鼠腹腔接種新孢子蟲(chóng)Nc-1速殖子2×106，首免佐劑為弗氏完全佐劑，二免、三免為弗氏不完全佐劑，免疫劑量、程序見(jiàn)表2。每次免疫前1 d采血檢測(cè)小鼠新孢子蟲(chóng)抗體水平。接種后30 d處死小鼠，取20 mg腦組織，RT-PCR檢測(cè)新孢子蟲(chóng)的28S和Nc5轉(zhuǎn)錄情況，以代表小鼠腦內(nèi)荷蟲(chóng)量，引物分別為28S上游引物TGCCATGGTAATCCTGCTCA，下游引物CCTCAGCCAAGCACATACACC；Nc5上游引物ACTGGAGGCACGCTGAACAC和下游引物AACAATGCTTCGCAAGAGGAA[12]。

表2 小鼠的免疫、攻蟲(chóng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 2 The experimental design of immunization and inoculation

組別Groups一免1stimmunization二免2ndimmunization三免3rdimmunization攻蟲(chóng)(速殖子)Challenge(Tachyzoite)空白組----PBS組100μL100μL100μLNc1(2×106)rNcGRA6100μg+佐劑50μg+佐劑50μg+佐劑Nc1(2×106)pcDNA-NcGRA6100μg100μg100μgNc1(2×106)pcDNA3.1(+)100μg100μg100μgNc1(2×106)

2 結(jié) 果

2.1NcGRA6的基本特征

NcGRA6(NCLIV_052880)不含內(nèi)含子，共582個(gè)堿基，編碼193個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量20.589 ku，理論等電點(diǎn)4.87，與弓形蟲(chóng)VEG株的GRA6氨基酸相似性36%。存在2段跨膜區(qū)，分別位于第13位到35位氨基酸與第155位到172位氨基酸，N端的跨膜區(qū)為信號(hào)肽。

2.2 基因擴(kuò)增

NcGRA6共582 bp，為了更好地表達(dá)蛋白質(zhì)，去除了前端126 bp信號(hào)肽序列，擴(kuò)增目的基因?yàn)?56 bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物送睿博新科公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 NcGRA6基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of NcGRA6 amplification

2.3 原核和真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定

回收目的基因片段，連接T載體，分別用EcoRⅠ和XhoⅠ與HindⅢ和XbaⅠ對(duì)構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，見(jiàn)圖2。

圖2 NcGRA6原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-GRA6(A)和GRA6真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GRA6(B)酶切鑒定Fig.2 Identification of pGEX-GRA6 (A) and pcDNA-GRA6 (B) by enzyme digestion

2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)與鑒定

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pGEX-GRA6，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)rNcGRA6蛋白表達(dá)情況(圖3A)。將純化蛋白轉(zhuǎn)膜，以GRA6多抗為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定，NcGRA6與GST融合表達(dá)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為37 ku，與預(yù)期大小相符，見(jiàn)圖3B。

2.5 亞細(xì)胞定位

用anti-GRA6鼠源多克隆抗體為一抗，以FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的新孢子蟲(chóng)進(jìn)行IFA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲(chóng)在各個(gè)階段(1個(gè)、2個(gè)、4個(gè)至多個(gè)速殖子)的GRA6均定位于整個(gè)納蟲(chóng)空泡網(wǎng)狀系統(tǒng)。圖4為納蟲(chóng)空泡內(nèi)存在多個(gè)蟲(chóng)體時(shí)的IFA檢測(cè)結(jié)果。

2.6 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

以anti-his單抗作為一抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗，對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA-NcGRA6的細(xì)胞(A)以及轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)空載體的細(xì)胞(B)進(jìn)行IFA檢測(cè)，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光(圖5)，說(shuō)明pcDNA-NcGRA6真核質(zhì)粒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

1.未誘導(dǎo)；2-6.誘導(dǎo)2、3、4、5、6 h；7.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.Not induced；2-6.2-6 h after induction；7.Protein marker圖3 GRA6重組蛋白表達(dá)(A)及Western blot鑒定(B)Fig.3 Expression of GRA6 recombinant protein (A) and identification by Western blot (B)

圖4 GRA6在新孢子蟲(chóng)的定位(bar=5.00 μm)Fig.4 Localization of GRA6 in Neospora caninum(bar=5.00 μm)

A.pcDNA-NcGRA6轉(zhuǎn)染細(xì)胞；B.空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞A.HEK293T cells transfected with pcDNA-NcGRA6；B.HEK293T cells transfected with pcDNA3.1(+)圖5 pcDNA-NcGRA6真核質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞的表達(dá)Fig.5 Expression of eukaryotic expression plasmid pcDNA-NcGRA6 in HEK 293T cells

2.7 NcGRA6對(duì)小鼠免疫效力的檢測(cè)

2.7.1 抗體水平 每次免疫前1 d采集小鼠血液，血清抗體水平見(jiàn)圖6。隨著免疫次數(shù)的增加，其抗體滴度逐漸上升；重組蛋白rNcGRA6免疫小鼠產(chǎn)生的抗體滴度高于真核質(zhì)粒免疫小鼠，三免后的抗體滴度達(dá)106～107，真核質(zhì)粒免疫鼠的抗體滴度達(dá)104。

圖6 不同組免疫小鼠的血清抗體變化Fig.6 Change of serum antibody in different immune groups of mice

2.7.2 腦內(nèi)荷蟲(chóng)量 采用Real-time PCR檢測(cè)小鼠腦內(nèi)荷蟲(chóng)量。將未免疫攻蟲(chóng)組小鼠腦內(nèi)新孢子蟲(chóng)mRNA轉(zhuǎn)錄水平設(shè)定為1，各免疫組小鼠腦內(nèi)新孢子蟲(chóng)mRNA與未免疫攻蟲(chóng)組小鼠腦內(nèi)新孢子蟲(chóng)mRNA的比值，得到相對(duì)荷蟲(chóng)量，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：經(jīng)rNcGRA6蛋白與核酸疫苗免疫小鼠的腦內(nèi)新孢子蟲(chóng)mRNA含量均大大低于未免疫攻蟲(chóng)組小鼠，與未免疫攻蟲(chóng)組、空白組和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒免疫組小鼠相比差異均顯著(P<0.05)，意味著免疫組小鼠獲得了較好保護(hù)，見(jiàn)圖7。

“*”代表差異顯著(P<0.05)“*”means significant difference (P<0.05)圖7 不同處理組 BALB/c小鼠腦內(nèi)新孢子蟲(chóng)相對(duì)荷蟲(chóng)量Fig.7 BALB/c brain relative burden of Neospora caninum in different groups

3 討 論

致密顆粒蛋白是頂復(fù)亞門(mén)原蟲(chóng)的一類(lèi)重要功能蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和功能多樣，主要功能是參與形成納蟲(chóng)空泡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行修飾，調(diào)控納蟲(chóng)空泡內(nèi)蟲(chóng)體的同時(shí)分裂，參與蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換以及自身廢棄物排出。致密顆粒蛋白對(duì)納蟲(chóng)空泡的形成及其功能的發(fā)揮具有重要的作用。

迄今，已在弓形蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)21種致密顆粒蛋白。見(jiàn)于報(bào)道的新孢子蟲(chóng)致密顆粒蛋白已有6種，分別是NcGRA1、NcGRA2、NcGRA6、NcGRA7、NcGRA14和NcNTP。Y.Nishikawa 等對(duì)NcGRA7蛋白的免疫原性進(jìn)行了研究，將該蛋白質(zhì)包埋于由甘露三糖包被的脂質(zhì)體中，然后皮下免疫小鼠，結(jié)果顯示NcGRA7可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性Th1型免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。攻蟲(chóng)試驗(yàn)后，PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示免疫組小鼠腦組織中新孢子蟲(chóng)DNA 含量較對(duì)照組降低了66.7%。此外，NcGRA7免疫可以有效阻斷新孢子蟲(chóng)的垂直傳播[13]。J.Ellis 等發(fā)現(xiàn)NcGRA2 是新孢子蟲(chóng)速殖子表達(dá)量較大的一種致密顆粒蛋白，該蛋白質(zhì)與其他成分聯(lián)合作為重組疫苗可以有效抵御新孢子蟲(chóng)速殖子感染[14]。上述基于新孢子蟲(chóng)致密顆粒抗原的疫苗研究證實(shí)其可以作為疫苗候選抗原之一，用于降低新孢子蟲(chóng)感染率。

NcGRA6是從新孢子蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)中篩選獲得的，與弓形蟲(chóng)GRA6氨基酸序列相似性為34%。在弓形蟲(chóng)中，GRA6在速殖子和緩殖子中均有表達(dá)，是弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白多樣性的典型標(biāo)簽[15]，定位于弓形蟲(chóng)速殖子致密顆粒，在納蟲(chóng)空泡內(nèi)與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合。本研究從新孢子蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增獲得NcGRA6，分析該基因結(jié)構(gòu)，進(jìn)行原核表達(dá)及真核表達(dá)，確認(rèn)該蛋白質(zhì)最終定位于納蟲(chóng)空泡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。推測(cè)NcGRA6可能與其他頂復(fù)亞門(mén)原蟲(chóng)中的功能較為一致，在納蟲(chóng)空泡的形成、蟲(chóng)體營(yíng)養(yǎng)與代謝物的運(yùn)輸和排泄中發(fā)揮重要作用。S.Ramamoorthy等利用布氏桿菌PR51表達(dá)NcGRA6，免疫C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)NcGRA6具有較好的阻止小鼠新孢子蟲(chóng)病垂直傳播的免疫保護(hù)效果[16]。本研究用NcGRA6的重組蛋白質(zhì)和真核表達(dá)質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，攻蟲(chóng)后發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠腦內(nèi)荷蟲(chóng)量明顯低于未免疫小鼠，說(shuō)明NcGRA6對(duì)新孢子蟲(chóng)的感染具有很好的保護(hù)效力，同樣提示NcGRA6可以作為新孢子蟲(chóng)病疫苗研究的主要候選抗原。

4 結(jié) 論

新孢子蟲(chóng)GRA6蛋白定位于納蟲(chóng)空泡的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中；用NcGRA6的重組蛋白質(zhì)和真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后，對(duì)新孢子蟲(chóng)的感染具有很好的保護(hù)效力，提示NcGRA6可以作為新孢子蟲(chóng)病疫苗研究的主要候選抗原。

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(編輯 白永平)

NeosporacaninumGRA6 Recombinant Expression，Localization and Preliminary Analysis on the Mice Immune Effect

XING Ming，LIU Jing，WANG Hui，HAO Pan，LIU Qun*

(NationalAnimalProtozoaLaboratory/KeyLaboratoryofAnimalEpidemiologyandZoonosisofMinistryofAgriculture，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

A variety of proteins are released during protozoan parasites invasion and growth in the host cell.Dense Granule protein is one of the key proteins which form and modify the parasitophorous vacuolar (PV).GRA6 gene was cloned fromNeosporacaninumgenomic DNA.We constructed prokaryotic expression vector pGEX-GRA6 and eukaryotic expression vector pcDNA-GRA6.The protein was purified and immunized BALB/c mice to obtained high titer of serum.Results of indirect immunofluorescence (IFA) showed that GRA6 located at parasitophorous vacuolar network structure (PVN).BALB/c mice were immunized with recombinant protein or eukaryotic expression vector and challenged withNeosporacaninum(2×106).We monitored clinical symptoms and detected antibody levels of mice before each immunization.Thirty days after infection，brain burden ofNeosporacaninumwas detected by RT-PCR.There were significant difference between immunization groups and control group (P<0.05)，which indicated that NcGRA6 had good immunoprotection for mice in both recombinant protein and eukaryotic expression vector.

Neosporacaninum；GRA6；localization；immunogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.016

2014-08-14

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2015CB150300)；北京市自然科學(xué)基金(6131001)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(2013XJ001)；教育部博士點(diǎn)基金(20130008120010)

邢 明(1987-)，女，遼寧朝陽(yáng)人，碩士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)研究，E-mail：xingming1002@sina.com；劉 晶(1978-)，女，黑龍江人，博士，副教授，主要從事獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)研究，E-mail：liujingvet@cau.edu.cn。二人共為第一作者

*通信作者：劉 群， E-mail:qunliu@cau.edu.cn

S852.723

A

0366-6964(2015)04-0624-07