惡性瘧原蟲動(dòng)物模型及基因編輯研究進(jìn)展

匡德宣， 王文廣， 孫曉梅， 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 昆明650118)

瘧原蟲是引起瘧疾的主要病原體， 瘧疾與艾滋病、結(jié)核病一起被世界衛(wèi)生組織列為全球亟需控制的公共衛(wèi)生問題， 是聯(lián)合國千年發(fā)展目標(biāo)中重點(diǎn)防控的3種傳染病之一[1]。目前發(fā)現(xiàn)的可寄生人體的瘧原蟲有五種： 惡性瘧原蟲(Plasmodium. falciparum)、間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malariae)、卵形瘧原蟲(P. ovale)和諾氏瘧原蟲(P.Knowlesi)，其中對(duì)人類危害最嚴(yán)重的是惡性瘧原蟲。自從1880年Laveran 在惡性瘧病人血液中發(fā)現(xiàn)瘧原蟲以來， 瘧疾仍是全球范圍內(nèi)危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一， 目前全球有 99個(gè)國家和地區(qū)流行瘧疾， 約33億人受到瘧疾威脅， 每年約有 2億瘧疾病例， 66萬人死于瘧疾感染[2]。在世界范圍內(nèi)， 人類對(duì)人瘧原蟲生理、生化、感染和慢性致病機(jī)制、藥理免疫以及人瘧原蟲疫苗的研制等方面進(jìn)行深入研究，均離不開合適的動(dòng)物模型。雖然科學(xué)家曾嘗試使用非人靈長類、免疫缺陷小鼠、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等開展惡性瘧原蟲動(dòng)物模型研究，但結(jié)果各有優(yōu)缺點(diǎn)。本文對(duì)惡性瘧原蟲動(dòng)物模型及基因編輯研究做一綜述，以供參考。

1 惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)模型

惡性瘧原蟲是人體感染瘧原蟲種類中致死率最高的蟲種，同時(shí)也是目前研究最多并唯一能在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)的瘧原蟲蟲種[3]。Geiman等[4]用惡性瘧原蟲證實(shí)美洲夜猴可作為人瘧原蟲的實(shí)驗(yàn)宿主， 揭開了體外連續(xù)培養(yǎng)瘧原蟲的序幕。隨后Trager等[5]通過改進(jìn)形成燭缸靜止法和流動(dòng)瓶法，取得了惡性瘧原蟲紅內(nèi)期(erythrocytic stage)體外培養(yǎng)的歷史性突破，首次報(bào)道了從夜猴身上引種的人惡性瘧原蟲抗氯喹株成功進(jìn)行體外連續(xù)培養(yǎng)，建立了惡性瘧原蟲越南FVO株的連續(xù)培養(yǎng)方法。1983年云南省瘧疾防治研究所成功培養(yǎng)一株惡性瘧原蟲，此后培育出12個(gè)分離株，建立了適合體外生長的蟲庫[6]。Fandeur等[7]用松鼠猴紅細(xì)胞對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)，雖然惡性瘧原蟲在松鼠猴紅細(xì)胞內(nèi)連續(xù)生長時(shí)間未超過3周，但已為人惡性瘧原蟲松鼠猴動(dòng)物模型的研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。謝苑靈等[8]應(yīng)用體外連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法對(duì)黑葉猴、熊猴、紅面猴、獼猴、果子貍、長爪沙鼠、家兔、白掌長臂猿(泰國產(chǎn))等8 種動(dòng)物進(jìn)行易感性實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示，黑葉猴、熊猴、紅面猴、獼猴、果子貍、長爪沙鼠以及家兔均屬不易感動(dòng)物，而在白掌長臂猿則顯示相當(dāng)?shù)囊赘行?。通過對(duì)各種動(dòng)物進(jìn)行人惡性瘧原蟲體外連續(xù)培養(yǎng)的易感性試驗(yàn)將為人瘧原蟲動(dòng)物模型的研究提供了一種準(zhǔn)確、快速、節(jié)約的好方法。

迄今， 國外學(xué)者[9]相繼建立了4種人類瘧原蟲紅外期(exo-erythrocytic stage)體外培養(yǎng)技術(shù)以及惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株， 已廣泛應(yīng)用于抗瘧藥物敏感性研究、抗瘧藥物篩選、抗藥性瘧原蟲培育與抗性消長等各個(gè)領(lǐng)域， 并以此為基礎(chǔ)開展了有關(guān)的瘧原蟲生物學(xué)與免疫學(xué)研究， 帶動(dòng)了瘧原蟲免疫、生理、生化、疫苗研制、診斷等學(xué)科的發(fā)展。惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的成功，不僅可以在人瘧原蟲的某些研究領(lǐng)域取代來源困難、價(jià)格昂貴的模型動(dòng)物，又為開展其它瘧原蟲的體外培養(yǎng)研究提供了借鑒方法。

2 惡性瘧原蟲體內(nèi)感染動(dòng)物模型

2.1 惡性瘧原蟲感染類人猿模型

Mesnil等[10]首先報(bào)告以間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲感染黑猩猩(chimpanzee)獲得成功，該報(bào)告曾被認(rèn)為是人瘧原蟲接種動(dòng)物獲得成功的第一個(gè)紀(jì)錄，但3年后他們自己否定了以間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲接種黑猩猩獲得成功的觀點(diǎn)[11]。Rodhain等[12]相繼作了間日瘧原蟲接種黑猩猩獲得成功的報(bào)道，接種前把黑猩猩脾臟切除，在短時(shí)間內(nèi)可以產(chǎn)生高度的蟲血癥。描述了瘧原蟲在黑猩猩體內(nèi)的全部繁殖過程，還肯定了切除脾臟是建立瘧原蟲模型的有效手段。雖然如此， 但對(duì)黑猩猩作為人瘧原蟲模型的深入研究始于1950年代末期。黑猩猩對(duì)間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲都有一定的感受性，但對(duì)間日瘧原蟲的感受性較好[13，14]。Cadigan 等[15]首先發(fā)現(xiàn)泰國的白掌長臂猿(Hylobat eslarlar)對(duì)惡性瘧原蟲的血液傳播有部分的感受性， 證明用惡性瘧原蟲血液傳播或蚊傳播均可使切除脾臟的白掌長臂猿產(chǎn)生蟲血癥。隨后也有學(xué)者[16]做了這方面的研究， 結(jié)果均不理想。黑猩猩和白掌長臂猿由于其自身的局限性——數(shù)量極少， 正面臨種群滅絕; 體形大， 對(duì)飼養(yǎng)和管理要求高; 費(fèi)用昂貴，不易獲得等因素限制了其在瘧原蟲研究中的應(yīng)用。

2.2 惡性瘧原蟲感染夜猴模型

Taliaferro等[17]用惡性瘧原蟲接種到巴拿馬產(chǎn)的吼猴(Aloutta palliata)嬰猴體內(nèi)， 取得令人鼓舞的進(jìn)展， 被西方大部分學(xué)者認(rèn)為人瘧原蟲接種動(dòng)物獲得成功的第一個(gè)確鑿記載， 是美洲夜猴(Aotus trivirgatus)取得真正成功的先導(dǎo)。Young等[18]首先以間日瘧原蟲患者的血接種夜猴獲得成功，是人瘧原蟲動(dòng)物模型研究中的最大突破。Gieman等[19]報(bào)道以惡性瘧原蟲患者的鮮血接種于切除脾臟的夜猴， 第1代原蟲的密度可達(dá) 1.8 × 105個(gè) /mm3， 連續(xù)傳代， 被寄生的紅細(xì)胞率可以達(dá)到87%。Hickman等[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果略有出入，但他們發(fā)現(xiàn)切除脾臟和未切除脾臟的夜猴對(duì)惡性瘧原蟲的感受性頗為相近： 第1次轉(zhuǎn)種傳代8 d時(shí)切除脾臟的夜猴瘧原蟲密度達(dá)到3×105個(gè)/mm3，而未經(jīng)切除脾臟的夜猴在接種14 d時(shí)也能達(dá)到同樣的水平。Contaeos等[21]實(shí)驗(yàn)證明夜猴體內(nèi)所產(chǎn)生的惡性瘧原蟲的配子母體對(duì)弗氏按蚊(anopheles freeborni)有高度感染力， 病猴體內(nèi)的血對(duì)弗氏按蚊的感染力可維持40 d， 其中16 d時(shí)猴血對(duì)該蚊的感染力竟達(dá)100%， 而在一個(gè)蚊胃中的卵囊數(shù)目可超過50個(gè)， 受染的蚊可以將惡性瘧原蟲回傳給健康人。從上述文獻(xiàn)看來，夜猴作為惡性瘧原蟲動(dòng)物模型是比較理想的，可應(yīng)用于惡性瘧原蟲的生理、生化、病理、藥理和免疫等各方面的研究。

2.3 惡性瘧原蟲感染獼猴、熊猴及松鼠猴模型

江靜波等[22]建立了惡性瘧原蟲感染獼猴(Macaca mulatta)和熊猴(Macaca assamensis)模型。將19只熊猴和獼猴切除脾臟后，靜脈接受廣西百色地區(qū)一位惡性瘧原蟲患者的鮮血。當(dāng)原蟲密度達(dá)到高峰期，通過換人血方法使惡性瘧原蟲在獼猴與熊猴之間轉(zhuǎn)種傳代。接種或轉(zhuǎn)種后逐日檢查發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲在獼猴和熊猴體內(nèi)繁殖及其原蟲密度和患病程度有明顯差別。5只獼猴和3只熊猴出現(xiàn)高蟲血癥，原蟲密度均在20%以上，出現(xiàn)嚴(yán)重貧血、衰竭及內(nèi)臟大出血等腦型瘧死亡。Gysin等[23]在建立惡性瘧原蟲感染松鼠猴(Saimiri sciureus)模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。將部分松鼠猴在接種前切除脾臟，另一部分未切除脾臟，然后靜脈接種感染惡性瘧原蟲，經(jīng)臨床和生化觀察，部分松鼠猴出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)障礙及深度的昏迷的神經(jīng)癥狀，瘧原蟲感染紅細(xì)胞(parasitized red blood cells， PRBC)在腦血管的堆積率為49%～60%， 出現(xiàn)彌漫性腦水腫， 最終死于腦型瘧。從上述研究可以看出， 感染惡性瘧原蟲的靈長動(dòng)物中獼猴、熊猴及松鼠猴無論切除脾臟與否都可能發(fā)展成為腦型瘧癥狀，這與人類腦型瘧的發(fā)生頗為相似。盡管惡性瘧原蟲感染松鼠猴及熊猴發(fā)展成腦型瘧是不可預(yù)見的，但是通過非人靈長動(dòng)物模型可更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腦型瘧的病理機(jī)制。

2.4 惡性瘧原蟲感染免疫缺陷小鼠模型

近年來， 科研人員嘗試將免疫缺陷動(dòng)物用于惡性瘧疾的基礎(chǔ)性研究。目前應(yīng)用于瘧疾研究的免疫缺陷動(dòng)物主要有重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID) 小鼠和BXN小鼠。SCID小鼠根據(jù)遺傳背景的差異，包括C.B-17-scid小鼠、NOD LtSz-SCID小鼠和HRSJ (hr hr)-scid小鼠等。BXN小鼠 (bg bg·xid xid·nu nu)又稱NIH-Ⅲ小鼠，是bg基因、xid 基因和nu基因3基因突變小鼠。Tsuji等[24]用人類紅細(xì)胞 (human red blood cells，HRBC)代替SCID小鼠紅細(xì)胞，切除小鼠的脾，獲得了較為穩(wěn)定的原蟲血癥，建立了惡性瘧疾C.B-17-scid小鼠模型。Moore等[25]應(yīng)用人惡性瘧原蟲體外預(yù)適應(yīng)法(使瘧原蟲在體外培養(yǎng)時(shí)就逐漸適應(yīng)SCID小鼠血清或血漿或腹水)和脾臟切除術(shù)，建立了惡性瘧疾NOD LtSz-scid 小鼠模型，結(jié)果表明，從該模型中分離出來的瘧原蟲不僅在形態(tài)上與體外培養(yǎng)體系中的瘧原蟲相同，而且具備再侵入其他新鮮未被瘧原蟲感染的HRBC的能力。此外，NOD LtSz-scid小鼠模型中的有性期瘧原蟲配子體還具備對(duì)蚊媒的傳染力。Badell等[26]用BXN小鼠建立了惡性瘧疾的BXN小鼠模型， 他們使用了二氯甲基磷酸(dichloromethylene diphosphonate，Cl2MDP)和抗多形核中性粒細(xì)胞的單克隆抗體 NIMP-R14，以降低組織中巨噬細(xì)胞和血中多形核中性粒細(xì)胞的數(shù)目，同時(shí)將已感染惡性瘧原蟲的HRBC注射入BXN小鼠腹腔內(nèi)，然后每隔3～4 d，通過腹腔內(nèi)注射補(bǔ)充健康的HRBC，獲得長達(dá)120 d的穩(wěn)定蟲血癥，蟲血率約0.1%～5%，雖然低于南美靈長類動(dòng)物模型， 但接近于感染者體內(nèi)的蟲血率水平， 其每日變異度也與未經(jīng)治療患者體內(nèi)的蟲血癥相似[27]。這表明，如果惡性瘧疾的BXN小鼠模型能被眾多研究者認(rèn)同，那么它將在惡性瘧疾的研究中被廣泛推廣。Moreno等[28]用單克隆抗體NIMP-R14和脂質(zhì)體包裹的氯屈膦酸二鈉(clodronate)對(duì)NOD LtSz-SCID小鼠和BXN小鼠的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，觀測(cè)惡性瘧原蟲能否在這2種小鼠體內(nèi)存活以及存活的繁殖時(shí)間，并將NODLtSz-SCID小鼠模型和BXN小鼠模型進(jìn)行對(duì)比研究，他們的研究數(shù)據(jù)顯示，NOD LtSz-SCID小鼠模型的惡性瘧原蟲的感染率高于BXN小鼠模型，主要原因可能在于組織中巨噬細(xì)胞募集的減少。巨噬細(xì)胞與多形核中性粒細(xì)胞作為機(jī)體非特異性免疫防御系統(tǒng)的重要成員，在SCID小鼠和BXN 小鼠體內(nèi)也大量存在，承擔(dān)著過濾清除體外入侵的病原體、體內(nèi)產(chǎn)生的有害物和無用物質(zhì)的作用。使用免疫調(diào)節(jié)劑下調(diào)這2類細(xì)胞的數(shù)量及功能，可能有助于延長免疫缺陷小鼠體內(nèi)惡性瘧原蟲和人紅細(xì)胞的存活時(shí)間，并建立穩(wěn)定的惡性瘧疾紅內(nèi)期感染的動(dòng)物模型。

總上所述，盡管科學(xué)家們嘗試建立類人猿、夜猴、獼猴、熊猴及松鼠猴和免疫缺陷小鼠等惡性瘧原蟲動(dòng)物模型，但由于惡性瘧原蟲有嚴(yán)格的宿主選擇性，導(dǎo)致惡性瘧原蟲動(dòng)物模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，瘧原蟲蟲血癥維持時(shí)間較短，蟲血率水平較低，尚不能作為成熟模型應(yīng)用于惡性瘧疾的相關(guān)研究。因此，建立理想的體內(nèi)感染動(dòng)物模型仍然是國內(nèi)外學(xué)者急需解決的問題。

3 轉(zhuǎn)基因及基因編輯惡性瘧原蟲研究進(jìn)展

3.1 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在惡性瘧原蟲研究中的應(yīng)用

瘧原蟲的轉(zhuǎn)染過程是將克隆有外源基因序列的質(zhì)粒導(dǎo)入瘧原蟲細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中的質(zhì)粒或以游離體的形式存在，或插入到瘧原蟲的染色體中。惡性瘧原蟲經(jīng)歷了漫長的發(fā)展才成為實(shí)驗(yàn)室可基因操作的物種。Goonewarden等[29]首先進(jìn)行了瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染的開創(chuàng)性工作，為瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。隨后瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)展迅速， 大致經(jīng)歷了從最初短暫轉(zhuǎn)染[30]、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[31]、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒整合[32]、基因打靶技術(shù)[33]，一直到惡性瘧原蟲基因組的測(cè)序計(jì)劃完成等幾個(gè)階段[34]，使我們可以特異性地改變瘧原蟲基因，為深刻了解瘧原蟲生物學(xué)、致病機(jī)制、基因的表達(dá)和功能、抗藥性機(jī)制、疫苗研制等諸多方面的研究都提供了最具根本性的工具[35]。目前瘧原蟲的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要用于瘧原蟲啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、藥物抗性機(jī)制以及基因功能等方面的研究。

質(zhì)粒以游離形式存在的轉(zhuǎn)染適于瘧原蟲啟動(dòng)子的研究。通過對(duì)啟動(dòng)子基因序列的缺失，可確定啟動(dòng)子序列中的核心區(qū)和調(diào)控區(qū)。Horrocks等[36]對(duì)惡性瘧原蟲的增生細(xì)胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen，PCNA)啟動(dòng)子進(jìn)行了套式缺失分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)長470 bp的區(qū)域和位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的290～620bp區(qū)域?qū)τ行У膯?dòng)子活性是必需的，去掉該區(qū)域則報(bào)告基因完全不能表達(dá)。另外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)惡性瘧原蟲鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CAM)、二氫葉酸還原酶-胸腺嘧啶合成酶(dihydrofolate reductase thymidylate synthase，DHFR-TS)及其它基因的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行了檢測(cè)， 對(duì)獲得的資料進(jìn)行分析，惡性瘧原蟲不同基因啟動(dòng)子的順式調(diào)節(jié)因子在核苷酸序列上存在很大程度的差異， 其增強(qiáng)子彼此之間以及與真核細(xì)胞增強(qiáng)子間沒有明顯的同源性，表明惡性瘧原蟲形成了一套自己獨(dú)特的與酵母或更高級(jí)的真核細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄因子。

目前普遍認(rèn)為， 特異性藥物靶點(diǎn)的過表達(dá)是引起瘧原蟲藥物抗性的常見機(jī)制。一種方法是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在重組的瘧原蟲中模擬這一情形，從而評(píng)價(jià)潛在的藥物靶點(diǎn)過表達(dá)機(jī)制的相關(guān)性。另一種方法是在表達(dá)載體上建立一個(gè)cDNA文庫，并將這一文庫轉(zhuǎn)染入瘧原蟲中， 給予特異性藥物壓力后，就可以從一個(gè)混合的轉(zhuǎn)基因群體中篩選出具相關(guān)藥物抗性的蟲體，再通過提取質(zhì)粒可很容易地獲得與抗性相關(guān)的基因。此外，還可以將可能與藥物抗性有關(guān)的基因或等位基因從抗性株轉(zhuǎn)染至敏感株，以研究這些基因的作用。惡性瘧原蟲的氯哇抗性(chloroquine-resistant， CQR)決定區(qū)是染色體7的一個(gè)36 kb片段，包括cg2和cgl兩個(gè)基因， 其內(nèi)含有與CQR表現(xiàn)型相關(guān)的多態(tài)性。Fidock等[37]用氯哇敏感株的cg2和cgl序列替代氯哇抗性蟲株的相應(yīng)序列， 經(jīng)藥物檢測(cè)表明經(jīng)修飾的氯哇抗性株在CQR的程度上沒有改變， 從而提供了反對(duì)這一假說的證據(jù)。

瘧原蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)在基因功能研究方面的應(yīng)用主要是利用活細(xì)胞基因組DNA可與外源性DNA同源序列重組的性質(zhì)，對(duì)預(yù)先選擇的目的基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾以達(dá)到改變基因組某一特定基因的目的。在瘧原蟲基因敲除研究中， 瘧原蟲除蚊期的一些階段外，其余都是單倍體， 某個(gè)基因的缺失或插入失活極易產(chǎn)生功能敲除的突變體， 從而分析該基因所編碼蛋白的功能。Sultan等[38]構(gòu)建了血小板反應(yīng)素/血小板凝血酶敏感蛋白相關(guān)未名蛋白(thrombospondin related anonymous protein， TRAP)基因敲除的瘧原蟲突變株，證實(shí)TRAP蛋白對(duì)瘧原蟲子孢子侵入蚊唾液腺的分泌細(xì)胞以及宿主的肝細(xì)胞具有重要作用，同時(shí)在子孢子體外的滑行運(yùn)動(dòng)力也起到關(guān)鍵作用。Crabb等[39]構(gòu)建了結(jié)節(jié)相關(guān)的富組氨酸蛋白(knob associated histidine-rich protein，KAHRP)的惡性瘧原蟲突變株，這是惡性瘧原蟲首次被敲除的基因。KAHRP呈現(xiàn)在被原蟲寄生的紅細(xì)胞表面的結(jié)節(jié)中，敲除KAHRP后， 惡性瘧原蟲失去形成結(jié)節(jié)的能力，惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜蛋白1(plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1， PfEMP1)的定位也有改變， 表明KAHRP在結(jié)節(jié)的形成、PfEMP 1的組織及細(xì)胞黏附中具有重要地位。Triglia等[40]對(duì)惡性瘧原蟲中裂殖子表面蛋白1 (merozoite surface protein 1， MSP1)和頂膜抗原蛋白 1(apical membrane antigen 1， AMA-1)進(jìn)行基因敲除， 敲除惡性瘧原蟲的MSP1基因或AMA-1基因后原蟲不能成活，表明MSP1和AMA-1是完成原蟲生活史所必需的。Baldi等[41]利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)破壞了紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的棒狀體相關(guān)蛋白(rhoptry-associated protein 1，RAPI)基因，產(chǎn)生表達(dá)縮短的RAP1的惡性瘧原蟲突變株。結(jié)果表明在突變株中RAP1和RAP2的位置發(fā)生變化，RAP2沒有被運(yùn)輸?shù)桨魻铙w，而是位于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔相關(guān)的一個(gè)腔室內(nèi)，從而表明RAP2定位到棒狀體時(shí)需要RAP1，這一結(jié)果支持棒狀體的生物來源部分依賴于蟲體的分泌途徑的假說。

減毒活瘧原蟲疫苗可誘發(fā)機(jī)體有效的抗體免疫反應(yīng)，但由于其有致病的可能性而不能作為疫苗。通過利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除與瘧原蟲致病有關(guān)的某些基因，同時(shí)保留與瘧原蟲增殖能力和免疫原性有關(guān)的基因，從而保證減毒活瘧原蟲疫苗的安全性，為發(fā)展減毒活瘧原蟲疫苗提供了一個(gè)新的方法。瘧原蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)各種侯選疫苗抗原進(jìn)行細(xì)致的分析必然促進(jìn)瘧疾疫苗的研制，轉(zhuǎn)基因蟲株也可以用來研究潛在的藥物作用機(jī)制和相關(guān)抗性研究。

3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在惡性瘧原蟲研究中的應(yīng)用

CRISP/Cas9系統(tǒng)是一種新的可對(duì)靶基因組進(jìn)行定向修飾的系統(tǒng)，該系統(tǒng)為開發(fā)更簡易高效基因定點(diǎn)修飾技術(shù)提供了嶄新的平臺(tái)。一個(gè)典型的CRISPR/Cas9基因座由一個(gè)編碼Cas9蛋白的操縱子以及重復(fù)間隔序列組成， 重復(fù)間隔序列由多個(gè)相同的重復(fù)序列及其間隔序列組成，間隔序列可以特異性地識(shí)別外源核酸片段[42]。近幾年來， CRISPR/Cas9系統(tǒng)在瘧原蟲基因組的編輯中得到成功利用，提高了寄生蟲基因組的編輯效率，并在瘧原蟲的基因功能分析、藥物靶點(diǎn)和抗藥性研究、疫苗候選分子篩選等工作上得到了應(yīng)用。

Sollelis等[43]編輯惡性瘧原蟲基因獲得無標(biāo)記的、單核苷酸置換的突變體，并利用線性質(zhì)粒破壞外源性位點(diǎn)egfp。Zhang等[44]破壞了惡性瘧原蟲染色體2的kahrp位點(diǎn)和染色體7的eba-175位點(diǎn)，成功率達(dá)50%以上。Wagner等[45]指出，利用CRISPR基因組編輯技術(shù)，能夠在大約一周左右的時(shí)間內(nèi)，以高達(dá)100%的成功率，敲掉一個(gè)惡性瘧原蟲的基因，可以更快速進(jìn)行基因分析并推進(jìn)新藥物的開發(fā)。Kuang等[46]利用CRISPR/Cas9方法對(duì)惡性瘧原蟲內(nèi)源基因進(jìn)行標(biāo)簽和定點(diǎn)突變修飾，成功高效構(gòu)建酪蛋白激酶II (casein kinase II， CK2 ) 的兩個(gè)亞基蛋白(CK2β1，CK2α)以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine- threonine kinase， STK) 3個(gè)重組蟲株，為進(jìn)一步在基因水平研究惡性瘧原蟲奠定了基礎(chǔ)。總之，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)通過單基因敲除、外源基因插入、基因標(biāo)記、多基因敲除、大片段敲除等功能成功編輯瘧原蟲的基因，并大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，增加了靶向位點(diǎn)，擴(kuò)展了反向遺傳學(xué)的應(yīng)用，這些都充分表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以提高瘧原蟲的基因編輯效率。

瘧原蟲藥物抗性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)青蒿素抗性蟲株， 由于缺乏有效的基因編輯手段， 導(dǎo)致相關(guān)抗性基因研究進(jìn)展緩慢。Ariey等[47]報(bào)道c580y突變和瘧原蟲青蒿素抗性有關(guān)。Ghorbal等[48]利用CRISPR/Ca9系統(tǒng)在c580y位點(diǎn)引入突變， 觀察到c580y突變體生存率提高了13.5%， 驗(yàn)證了Ariey等的結(jié)論; 使用該系統(tǒng)分別靶向kahrp和orc1位點(diǎn)， 證實(shí)2個(gè)基因分別在瘧原蟲黏附宿主紅細(xì)胞和基因沉默中發(fā)揮重要作用。Ng等[49]利用該系統(tǒng)靶向惡性瘧原蟲的pfmdr1位點(diǎn)， 觀察到處于無性生殖期和配子體的瘧原蟲突變體對(duì)哌嗪類化合物ACT-451840產(chǎn)生抗性，但對(duì)臨床常見的苯芴醇、甲氟喹、奎寧和阿莫地喹等與青蒿素配合使用的藥物靈敏度增加， 對(duì)突變體進(jìn)行基因組測(cè)序， 觀察到pfmdr1位點(diǎn)具有單核苷酸多態(tài)性。這些結(jié)果表明， CRISPR/Ca9系統(tǒng)對(duì)發(fā)現(xiàn)青蒿素抗性相關(guān)基因和評(píng)估藥物的療效具有重要作用。

4 結(jié)語

目前， 許多重要的疫苗候選抗原己經(jīng)確定， 惡性瘧原蟲疫苗的研究也取得了很多進(jìn)展，但仍面臨著許多困難，其中最大困難之一就是缺乏廉價(jià)有效的動(dòng)物模型。許多惡性瘧原蟲疫苗在體外抑制實(shí)驗(yàn)或在小鼠和兔子等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠顯著抑制惡性瘧原蟲生長， 取得良好的免疫保護(hù)效果， 但由于遺傳背景的巨大差異、抗原分子體內(nèi)加工和遞呈的不同、人群MHC II類分子的限制性等影響， 在人體實(shí)驗(yàn)中往往無法達(dá)到預(yù)期的免疫保護(hù)作用。在高等的靈長類動(dòng)物中，黑猩猩和南美洲夜猴能感染惡性瘧原蟲， 可作疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。但黑猩猩瀕臨滅絕，來源稀缺且飼養(yǎng)價(jià)格昂貴。而南美洲夜猴并非是惡性瘧原蟲的天然宿主， 且來源非常有限，價(jià)格昂貴。因此， 尋找適宜的小動(dòng)物模型進(jìn)行瘧疾疫苗研發(fā)或藥物篩選十分必要。瘧原蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，為解決這一問題提供了一種方法和思路。

基因敲除技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物模型的建立， 而最成熟的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠，對(duì)于大型哺乳動(dòng)物的基因敲除模型還處于探索階段?；蚯贸齽?dòng)物模型一直以來是在活體動(dòng)物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟， 不僅流程繁瑣、對(duì)技術(shù)的要求很高， 而且費(fèi)用大， 耗時(shí)較長， 成功率受到多方面因素的影響。即使對(duì)于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。隨著表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的快速發(fā)展，可以將實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短到半年以內(nèi)，甚至更短，研究人員應(yīng)用新的技術(shù)手段對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行深入研究?？深A(yù)見轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲出/敲入及CRISPR/Cas9技術(shù)將是未來惡性瘧原蟲動(dòng)物模型研究的熱點(diǎn)。