環(huán)境暴露對精子小非編碼RNA介導跨代遺傳影響的研究進展

徐偲越，郭藝紅

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳?？漆t(yī)院，鄭州 450052)

表觀遺傳是指在不改變DNA序列的情況下基因表達的改變，這種改變可由外部環(huán)境所引起。目前，許多證據(jù)表明表觀遺傳信息可通過配子在子代中傳遞，這種形式被稱為跨代遺傳[1-3]。這種快速直接的遺傳方式具有一定的進化優(yōu)勢，能夠使后代更好地適應環(huán)境。以往大量研究發(fā)現(xiàn)母體的健康狀況及生活方式可通過表觀遺傳機制影響后代，如妊娠前肥胖、宮內(nèi)不良環(huán)境暴露等[4-6]。近年來，越來越多的證據(jù)表明父代的環(huán)境暴露及生活習慣也可通過精子跨代遺傳影響子代的表型[7-8]。由精子介導的跨代遺傳主要涉及DNA甲基化、組蛋白乙?；靶》蔷幋aRNA等。非編碼RNA(non-coding RNAs)是指DNA轉(zhuǎn)錄后不作為翻譯模板的一類功能性的RNA分子，可參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、RNA的加工及翻譯等[9-10]。其中長度小于200 nucleotide(nt)的非編碼RNA稱為小非編碼RNAs(small non-coding RNAs，sncRNAs)[11]。近年來，研究較多的主要有miRNA、piRNA、rbRNA、tRNA，這些sncRNAs被認為在跨代遺傳中發(fā)揮重要作用[12]。本文將對精子中的小非編碼RNA跨代遺傳機制進行綜述，重點闡述環(huán)境影響的正反兩方面在父代跨代遺傳中的作用。

一、不良環(huán)境的影響

(一)父代壓力及應激對后代表型的影響

壓力會影響性欲，降低精子數(shù)量和質(zhì)量，并長期危害睪丸細胞[13-14]。近年來大量研究表明壓力誘導的父代個體的行為適應性可通過精子表觀遺傳傳遞給后代。

1.壓力引起的行為變化：多種神經(jīng)/精神疾病與下丘腦-垂體-性腺軸(HPA軸)相關(guān)，如精神分裂癥、抑郁癥等[15]。相關(guān)研究表明父代遭受應激后可以通過誘導生殖細胞的表觀遺傳重編程并使后代HPA軸失調(diào)，隨后觀察發(fā)現(xiàn)精子中的miRNA含量發(fā)生變化[16]。研究人員進一步將這些被改變的miRNA注入到單細胞的受精卵中，來自這些受精卵的雌性和雄性小鼠也表現(xiàn)為HPA軸失調(diào)[17]。

為了研究父代壓力如何通過HPA軸失常對父代精子含量產(chǎn)生影響以及由此介導的行為變化，國外一研究小組給交配之前的雄性小鼠(F0代)持續(xù)4周服用含有糖皮質(zhì)激素(CORT)的水來模擬應激狀態(tài)下父代小鼠的生理變化[18]，在高架十字迷宮(一種測試動物焦慮狀態(tài)的模型)及明暗箱實驗中，盡管CORT并不影響父代雄性小鼠的焦慮行為，但CORT組F1雄性小鼠表現(xiàn)為焦慮樣行為，CORT組F1雌性小鼠表現(xiàn)為恐懼消失。有趣的是，父本印記基因Igf2的表達在F1雄性后代參與應激的海馬中增加，但在雌性后代中下調(diào)。而與對照組相比，CORT組F2雄性和雌性小鼠均表現(xiàn)為焦慮程度降低，并發(fā)現(xiàn)只有CORT組F2雄性小鼠減少了在強迫游泳實驗(抑郁行為實驗)中的活動；與對照組相比，CORT組后代發(fā)現(xiàn)差異表達的sncRNAs超過100種，其中數(shù)量最多的兩大類為miRNA和tRNA。來自CORT組精子中三種miRNA(miR-98、miR-144和miR-190b)水平升高，預計它們會與多種生長因子(包括兩種基本生長因Igf2和Bdnf)相互作用。研究表明，壓力(通過壓力經(jīng)歷)和升高的應激激素水平(通過服用CORT)可以改變精子miRNA的含量，并且這些變化至少影響兩代。至于這些性別差異是如何發(fā)生的，目前尚無相關(guān)明確機制，有人提出性染色體可以通過HPA軸影響性腺激素水平，進而表現(xiàn)為不同的行為特征[19]。

一種將不可預測的母體分離與不可預測的母體應激相結(jié)合(model of unpredictable maternal separation combined with unpredictable maternal stress，MSUS)的小鼠模型為我們研究表觀遺傳提供了很好的思路，這種早期暴露于創(chuàng)傷性壓力的模型可形象地轉(zhuǎn)化為人類的童年壓力及創(chuàng)傷[20-21]。在MSUS模型中早期應激小鼠(F0)可影響后代行為特征及sncRNAs含量。在高架十字迷宮及明暗箱等行為實驗中，F(xiàn)1 MSUS小鼠表現(xiàn)出了類似焦慮的行為特征，這些獲得性的性狀在F2 MSUS小鼠也被觀察到。研究者應用PCR及深度測序分析顯示，在F1 MSUS小鼠精液中部分miRNA上調(diào)，而部分piRNA下調(diào)。除此之外，成年F1 MSUS小鼠的血清及海馬的sncRNAs也發(fā)生了改變。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，盡管F3 MSUS小鼠與F1及F2 MSUS小鼠有相似的行為特征，但sncRNAs在F2 MSUS小鼠的血清及海馬中受到影響，在精子中卻未發(fā)生任何改變，而F3 MSUS小鼠的sncRNAs是正常。值得注意的是，當將這些差異表達的sncRNAs注射到野生型受精的卵母細胞中時，來自這些受精卵的小鼠表現(xiàn)出與F0 MSUS類似的行為變化和分子效應，并且檢測到海馬中的某些sncRNAs發(fā)生顯著變化；注射有sncRNAs受精卵的小鼠后代亦有類似抑郁的表現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)都說明了精子miRNAs在跨代遺傳中的直接作用，強調(diào)了miRNAs在生殖細胞中的重要性及對早期應激的敏感性[20]。

2.壓力引起的代謝變化：在壓力環(huán)境中除了引起后代行為變化之外，亦對代謝產(chǎn)生一定影響。MSUS模型中研究者測定了壓力對代謝的影響[20]，在F1 MSUS小鼠中，血清中的胰島素和葡萄糖水平都顯示在正常水平，F(xiàn)2 MSUS小鼠雖然葡萄糖水平尚在正常范圍，而胰島素水平低于正常對照組，且在胰島素耐受實驗和葡萄糖耐受實驗中均下降；F2 MSUS小鼠亦表現(xiàn)為一種超代謝，在攝入量較高的情況下，體重仍低于對照組。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，來自注射sncRNAs受精卵的小鼠胰島素和血糖水平降低，體重下降。表明父代壓力引起葡萄糖代謝的變化，并通過精子sncRNAs在跨代遺傳中發(fā)揮作用。有壓力的F0雄鼠后代F1雌鼠的糖皮質(zhì)激素水平明顯升高[22]。與F1雌鼠不同的是，F(xiàn)2和F3雌鼠并沒有表現(xiàn)出增強的糖皮質(zhì)激素水平，但繼承了父代相關(guān)的行為。此外，所有雌性小鼠(從F0到F3)均顯示Rcan 1和Rcan 2的mRNA水平升高，這與海馬CA1區(qū)域的突觸可塑性有關(guān)。

我國學者亦對父代應激引起子代代謝變化做了相關(guān)研究。研究者發(fā)現(xiàn)F0雄鼠應激后糖皮質(zhì)激素水平升高，從而引起控制miRNA-466l-3p表達的精子Sfmbt2基因啟動子甲基化程度增加，這種表觀遺傳修飾導致子代肝臟中的miRNA-466l-3p表達顯著下調(diào)，從而調(diào)節(jié)PKPCK蛋白表達增加，引起子代F1小鼠血糖升高、糖異生增加[23]。

(二)父代飲食對后代表型的影響

在哺乳動物中，跨代遺傳不僅發(fā)生在壓力環(huán)境中，父代飲食變化亦通過精子跨代遺傳導致子代表型發(fā)生改變[24-25]。Fullston等[26]為了研究飲食引起的父代肥胖對后代代謝健康及精子分子結(jié)構(gòu)的影響，將F0代C57BL/6J雄鼠喂食高脂肪食物(high fat diet，HFD)或控制飲食(control diet，CD)10周，隨后研究者將兩代F1及F2都進行CD維持，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD組F0雄鼠的肥胖增加21%并且其后代F1和F2都增加了肥胖及胰島素抵抗的風險，其中F1雌鼠肥胖增加67%，F(xiàn)2雄鼠肥胖增加24%；通過微陣列、PCR等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)F0雄性肥胖改變了睪丸中的414個微陣列和11個miRNA的表達，同時改變了精子的miRNA含量。而Thais等[27]與上述研究結(jié)論并不一致，他們研究發(fā)現(xiàn)HFD組的后代中，雌鼠表現(xiàn)為葡萄糖不耐受，并且容易引起HFD誘導的體重增加，而HDF的F0及F1雄鼠其DNA甲基化和sncRNAs表達正常。結(jié)果顯示這種跨代遺傳是通過miRNA let-7c在精子中的的表達改變傳遞到后代的代謝組織中，從而誘導let-7c靶點的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生移位。在HFD父代小鼠模型中，Chen等[8]發(fā)現(xiàn)了精子tRNA衍生的小RNA(tsRNA)表達譜和修飾的變化；將來自HFD雄性的精子tsRNA注射到正常受精卵中，在F1后代中發(fā)生代謝紊亂，并且在早期胚胎和F1后代的胰島中改變了代謝途徑的基因表達。

雖然精子sncRNAs如何編碼父系信息仍不清楚，但其機制可能涉及RNA修飾。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)刪除小鼠中的tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶—Dnmt2后將會阻止精子sncRNA介導的高脂飲食誘導的代謝紊亂傳播給后代。研究顯示Dnmt2缺失阻止了高脂飲食誘導的精子30-40 nt RNA部分RNA提取物(m5C、m2G)的升高；此外，Dnmt2缺失改變了精子小RNA表達譜，包括tRNA衍生的小RNAs和rRNA衍生的小RNAs的水平，這可能在構(gòu)建父系表觀遺傳記憶所需的精子RNA編碼中是必需的。Sharma等[29]調(diào)查了父代飲食影響子代代謝的機制：小鼠的低蛋白飲食將影響成熟精子中的小RNA(sRNA)水平，導致let-7水平降低和～28-34 nt tRNA片段(tRFs)數(shù)量增加(主要來自于tRNA的5’端)；其機制為睪丸中的精子tsRNA片段較少，當進入附睪后，附睪體(在附睪運輸過程中與精子融合的囊泡)攜帶成熟精子相匹配的tsRNA載體，將tsRNA傳遞給成熟精子，使精子中的tsRNA片段增加。Chen等[8]將附睪體中的tsRNA 注入到正常的胚胎中，結(jié)果顯示：tsRNA 引起了胚泡多種基因表達量的改變并且大部分基因在機體的代謝調(diào)控通路中表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)tRNA及tsRNA的修飾均會影響tsRNA的功能，從而影響遺傳相關(guān)的代謝疾病。

(三)父代飲酒對后代表型的影響

近期研究表明，不僅孕期飲酒增加后代代謝風險，父代長期飲酒也可能對后代的健康和發(fā)育產(chǎn)生重要影響。Rompala等[30]應用高通量測序證實了乙醇對精子sncRNAs的影響：他們發(fā)現(xiàn)慢性間歇性乙醇暴露改變了精子中三種主要的小RNA(tRNA衍生的小RNA、線粒體小RNA和微RNA的幾種sncRNAs)；另外利用PCR驗證了sncRNAs因慢性乙醇的暴露而改變；同時發(fā)現(xiàn)慢性乙醇暴露亦影響sncRNAs的轉(zhuǎn)錄后修飾，增加線粒體tRNA中兩種核苷修飾。

二、良好環(huán)境的影響

與壓力相反，積極的環(huán)境因素可以改善人類的壓力反應和認知能力。積極的環(huán)境包含增強體育鍛煉、多樣環(huán)境或其他形式的增強運動，如感覺、認知等刺激。多樣環(huán)境是一種將體育鍛煉與認知訓練相結(jié)合的方式。

(一)父系體育鍛煉對后代表型的影響

1.運動對行為影響：國外研究小組利用小鼠自行車運動模型對父代運動的跨代遺傳做了相關(guān)研究[31]：跑步者的雄性后代抑制了幼年恐懼記憶的恢復，并減少了成年后明暗箱實驗中的焦慮，而這些情感行為在女性后代中無明顯變化；跑步改變了精子中的miRNAs水平，其中包括三種獨特的miRNAs(miR-19b、miR-455和miR-133a)和兩種tRNA衍生的RNA(tDRs)(tRNA-Gly和tRNA-Pro)。這些均對RNA轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)節(jié)有重要作用，因此可改變大腦和相關(guān)情感行為的發(fā)育。

2.運動對代謝的影響：父代運動除了改善后代行為外，亦對代謝過程產(chǎn)生重要影響。自行車運動模型中運動的小鼠引起了DNA甲基化和精子miRNA含量的改變，以及雄性后代代謝過程的改變[32]。此外，研究者將肥胖雄性小鼠(通過高脂飲食誘導)進行游泳訓練作為一種運動方式(其誘導體重減輕)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動后的肥胖小鼠精子miRNA序列傾向于正常小鼠，且雌性后代的代謝過程能夠恢復[33]。Denham[34]發(fā)現(xiàn)父代的運動訓練會減弱精子中異常的microRNAs(其與高脂肪飲食及代謝功能障礙相關(guān))；在肥胖的父代中，盡管其雌性后代腎脂肪堆積較多，血漿甘油三酯及胰島素抵抗均較高，但運動干預能有效改善父代表觀遺傳的代謝后果：高脂肪引起的X染色體的精子miRNA的異常表達(miR-503、miR-542-3p和miR-465b-5p)，參與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡及胚胎發(fā)育，而這些異?？赏ㄟ^8周的運動干預而修復；父代運動后其骨骼肌磷酸脫氫酶激酶4(Pdk4，葡萄糖代謝的重要調(diào)節(jié)劑)mRNA表達減少，而后代的骨骼肌中表達也相應下降，說明運動誘導的精子表觀遺傳再編程可能導致了后代的骨骼肌基因的表型和轉(zhuǎn)錄的改變。

(二)多樣環(huán)境對后代表型的影響

1.多樣環(huán)境對神經(jīng)系統(tǒng)的影響：多樣環(huán)境可增強突觸可塑性、學習和記憶，并降低包括阿爾茨海默病在內(nèi)的各種復雜疾病的風險[35-36]。Benito等[37]利用玩具(以隧道、住房和形狀不同的物體)和輪子為小鼠創(chuàng)造多樣環(huán)境的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)相比于正常組，10周多樣環(huán)境刺激后的雄性小鼠F0其海馬LTP得到增強，并且其后代F1的海馬LTP亦得到相應增強，且有較明顯的認知優(yōu)勢；研究者將多樣環(huán)境刺激后的精液中的RNA注入到受精的卵母細胞中，其后代的認知評分有明顯增加；PCR測序發(fā)現(xiàn)在多樣環(huán)境刺激后雄性小鼠的精液及大腦中其miRNA212/132水平增加并參與到跨代遺傳中。

最近研究證實，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)(常用抑郁癥治療方法)對抑郁小鼠的治療作用在多樣環(huán)境中作用最大[38]。研究者將抑郁樣表型的C57BL/6J小鼠暴露于多樣環(huán)境或應激狀態(tài)后使用SSRIs治療(21 d)，結(jié)果表明，在多樣環(huán)境條件下治療的小鼠抑郁樣表型總體上得到改善，而在應激條件下治療的小鼠顯示出明顯的惡化。此外，SSRIs能夠誘導幾種miRNA的上調(diào)，包括miR-135和miR-375。抑郁癥患者的血液中和大腦中miR-135的水平下降，SSRIs治療(CBT)后抑郁癥患者的miR-135水平升高[39]。

2.多樣環(huán)境對行為及代謝的影響：多樣環(huán)境通過跨代遺傳對后代行為及生理應激反應產(chǎn)生一定影響[40]。將成年C57BL/6J雄性小鼠(F0)暴露于多樣環(huán)境或標準鼠房4周，使用高架十字迷宮和曠場實驗測試8周齡雄性和雌性F1和F2后代的焦慮狀態(tài)，使用強迫游泳試驗評估抑郁相關(guān)行為；在基線水平和強迫游泳應激后，通過定量血清皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平來確定HPA軸功能。結(jié)果表明，多樣環(huán)境刺激后的雄性后代F1和F2的體重增加，焦慮和抑郁相關(guān)行為沒有顯著改變，雖然F2的焦慮行為沒有發(fā)生變化，但是這些小鼠在強迫游泳試驗中顯示出潛伏期縮短。

三、展望

以往人們認為父代對其子女的影響是由精子攜帶的遺傳物質(zhì)決定的，而它不受環(huán)境的影響。近年來大量研究表明，無論是不利的還是有利的生活環(huán)境都可通過sncRNAs介導跨代遺傳而影響后代的生理和行為表型。相關(guān)機制可以為疾病發(fā)展過程提供理論依據(jù)，并為改善人類健康提供新的治療方法。然而，對于理解跨代遺傳還有許多問題需要解決，如精子表觀基因組在復雜的環(huán)境中是怎樣編碼的，以及精子中的這些表觀遺傳修飾如何影響合子的發(fā)育及后代的行為。未來可通過系統(tǒng)地比較動物研究結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)，考察這些跨代遺傳是如何進行的。