推拿對(duì)兔腰椎間盤(pán)退變組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的影響*

趙小艷， 蘇程果，劉華輝，羅才貴，袁 曄，朱明雙△

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(成都 610075)；2.四川寶石花醫(yī)院 (成都 610213)

椎間盤(pán)退變是大多腰腿痛患者的共同病理基礎(chǔ)，已造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。國(guó)內(nèi)外已有椎間盤(pán)退變性疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法的相關(guān)研究[3-5]。研究[5]表明，推拿對(duì)椎間盤(pán)退變性疾病有著良好的臨床療效，而TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF與腰椎間盤(pán)退行性變關(guān)系密切。本研究觀察推拿對(duì)兔腰椎間盤(pán)退變組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量的變化，進(jìn)一步證實(shí)推拿對(duì)腰椎間盤(pán)退變性疾病的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4月齡新西蘭大白兔33只，體重2.0～2.5 kg，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(川) 2018-17。實(shí)驗(yàn)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，此次研究符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

ELISA試劑盒(MLBIO)；二甲苯(國(guó)藥集團(tuán))；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán))；乙二胺四乙酸二鈉(上海凌風(fēng))；氫氧化鈉(滬試)；新型脫鈣液(北京索萊寶)；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)；全自動(dòng)研磨儀(servbio生物 )；脫水機(jī) (武漢俊杰) 等。

1.3 造模分組

白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，先取3只動(dòng)物進(jìn)行造模預(yù)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)從中取1只通過(guò)耳緣靜脈空氣栓塞后解剖其腰椎組織，觀察兔腰椎解剖結(jié)構(gòu)。然后取2只借鑒黃杰烽等[6]的穿刺纖維環(huán)法進(jìn)行兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷ｎA(yù)實(shí)驗(yàn)，然后處死，解剖觀察到穿刺針刺入椎間盤(pán)。剩余30只白兔隨機(jī)分成空白組、模型組、推拿組，每組10只。除空白組外其他兩組均進(jìn)行兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷?，具體方法如下。造模前24 h禁食，稱(chēng)重并計(jì)算麻醉劑量，10%的水合氯醛按3 mL/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉。定位: 將動(dòng)物俯臥位放置固定、備皮、消毒。在兔最下端肋骨對(duì)應(yīng)椎體的下一個(gè)椎體棘突即為L(zhǎng)1棘突，髂棘高點(diǎn)平對(duì)L6椎體，依次標(biāo)記各段腰椎。左手拇指定位 L5、L6橫突末端連線中點(diǎn)，右手持針在左手定位點(diǎn)上方約1 cm處與地面水平緩慢進(jìn)針，破皮后針向頭側(cè)略傾斜20°，該點(diǎn)約平對(duì)L4-5椎間盤(pán)，即可穿刺到具有韌感的組織，若穿刺針下為堅(jiān)硬的骨性物，此時(shí)可向兔子頭側(cè)或尾側(cè)輕微調(diào)整即可穿刺到具有韌感的椎間盤(pán)，穿刺深度約5 mm，停留時(shí)間5 s。再依法穿刺L3-4、L5-6椎間盤(pán)，左右各穿刺1次。術(shù)后連續(xù) 3 d肌注青霉素40萬(wàn)U/只。

1.4 推拿

造模后第2天，對(duì)推拿組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期6周的推拿干預(yù)，空白組和模型組不予特殊處理，正常喂養(yǎng)。推拿手法參照成人推拿的臨床經(jīng)驗(yàn)手法，具體方法如下：1)從上往下按揉脊柱兩側(cè)膀胱經(jīng)，側(cè)重腰骶部分，約5 min， 操作緩慢滲透，以力透雙側(cè)豎脊肌深層；2)點(diǎn)按雙側(cè)膀胱經(jīng)腎俞、大腸俞、秩邊、環(huán)跳，約2 min；3)順膀胱經(jīng)彈撥脊柱兩側(cè)豎脊肌，約3 min。以上手法的輕重頻率均由專(zhuān)人經(jīng)訓(xùn)練后操作。治療 1 次/d， 10 min/次。

1.5 標(biāo)本采集

6 周后，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳緣靜脈空氣栓塞處死后，截取第L3至L6腰椎及其間的椎間盤(pán)組織，然后每組隨機(jī)選10個(gè)椎間盤(pán)放入-80°冰箱保存；另外每組隨機(jī)選6個(gè)椎間盤(pán)放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定24 h，預(yù)備做石蠟切片。

1.6 觀察與檢測(cè)

1.6.1 動(dòng)物反映綜合評(píng)分 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于造模后第1天、第1周、第3周、第6周，依據(jù)其精神情況、進(jìn)食量、運(yùn)動(dòng)量及對(duì)外界刺激的反應(yīng)4項(xiàng)進(jìn)行評(píng)估，參照黑龍等[7]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綜合反映評(píng)分，具體如下：每項(xiàng)正常2分，良好1分，很差0分?？偡?分為正常。

1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化 標(biāo)本24 h固定后，然后用新型脫鈣液脫鈣2個(gè)月，脫鈣液更換周期為2～3 d，然后依次梯度酒精進(jìn)行脫水與石蠟包埋，再以4 μm厚度切片，每個(gè)椎間盤(pán)標(biāo)本挑選2片切片，在光鏡下觀察椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化，根據(jù)Han等[8-9]的椎間盤(pán)退變組織學(xué)評(píng)估表評(píng)價(jià)椎間盤(pán)退變程度。從髓核形狀和大小、髓核中細(xì)胞和基質(zhì)構(gòu)成、纖維環(huán)形狀、纖維環(huán)中細(xì)胞的基質(zhì)構(gòu)成、纖維環(huán)和髓核的分界5項(xiàng)進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)正常計(jì)1分，輕度不規(guī)則計(jì)2分，重度不規(guī)則計(jì)3分?？偡?分為正常，15分為嚴(yán)重退變。

1.6.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)椎間盤(pán)中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量 提取出冰凍的椎間盤(pán)組織，用9倍勻漿介質(zhì)研磨。將研磨液以3 000 r/min，離心半徑5.5 cm，離心10 min，取上清液制作成10%的組織勻漿。然后進(jìn)行BCA定量，配制適量BCA工作液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，并以蒸餾水作為空白對(duì)照，再采用微孔板法計(jì)算樣品的蛋白濃度。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟采用ELISA法檢測(cè)椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腰椎間盤(pán)退變?cè)炷＝馄式Y(jié)果

白兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷＝馄屎螅@示L3至L6的椎間盤(pán)為乳白色的圓柱體，并逐漸增大，位于橫突前上方。且椎間盤(pán)為韌性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，穿刺到椎間盤(pán)時(shí)指下可感到滯澀沉緊感。椎間盤(pán)造模解剖圖如下(圖1)。

圖1 造模解剖圖

2.2 動(dòng)物反映綜合評(píng)分

各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物反映綜合反映評(píng)分的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；測(cè)試時(shí)間與動(dòng)物綜合反映評(píng)分的交互作用的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間比較整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表 1)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綜合反映評(píng)分(分，

注：數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，球形檢驗(yàn)P<0.05；多變量檢驗(yàn)中各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)P<0.05，測(cè)試時(shí)間*動(dòng)物綜合反映評(píng)分P<0.05；LSD組間兩兩比較P<0.05

2.3 各組椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)評(píng)分

空白組顯示：椎間盤(pán)中分布大小一致的圓形髓核細(xì)胞，細(xì)胞間基質(zhì)豐富緊密，髓核與纖維環(huán)分界清楚，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，排列清晰。模型組顯示:髓核細(xì)胞分布多不均勻，較多髓核細(xì)胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀，排列紊亂，胞核較少；局部纖維環(huán)結(jié)構(gòu)可出現(xiàn)紊亂，排列疏松不規(guī)則；纖維環(huán)和髓核界限多不清晰。推拿組顯示:髓核細(xì)胞分布稍均勻，較多髓核細(xì)胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀，胞核減少；周?chē)w維環(huán)可有紊亂；髓核與纖維環(huán)分界較不清晰。相比空白組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(5.17±0.41)，模型組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(10.33±2.07)和推拿組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(9.00±3.46)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。推拿組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分略低于模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)(HE,×200)

注：A、B：空白組；C、D：模型組；E、F：推拿組

2.4 各組椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

模型組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明穿刺椎間盤(pán)纖維環(huán)的方法促進(jìn)了白兔腰椎間盤(pán)TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表達(dá)；推拿組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF 表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明推拿可降低白兔椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表達(dá)(表2)。

表2 椎間盤(pán)中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

注:對(duì)比空白組，aP<0.05；對(duì)比模型組，bP<0.05

3 討論

細(xì)胞因子所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)被視為導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的因素之一，退變椎間盤(pán)中的髓核細(xì)胞可分泌IL-6、TNF-a等眾多炎癥因子,并對(duì)其產(chǎn)生反應(yīng)[10]。IL-6為炎癥促進(jìn)因子，可刺激炎癥細(xì)胞聚集，破壞蛋白聚糖Ⅱ型膠原的比例，促使髓核中水分丟失，從而加速椎間盤(pán)退變[11]。董振輝等[12]發(fā)現(xiàn)，外源性 IL-6 可通過(guò)P38MAPK 和P- JNK/SAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞凋亡。而TNF-α 亦叫做惡質(zhì)素，為重要的炎性因子[13]。TNF-α主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)活性，可促使血管擴(kuò)張、白細(xì)胞趨化，從而增多吞噬細(xì)胞，釋放內(nèi)毒素，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)，TNF-α的分泌量體現(xiàn)了炎癥程度[14]。TNF-α 不僅可活化巨噬細(xì)胞，且可與多種細(xì)胞因子( 如 IL-1，IL-6，IL-8 等) 相互作用，進(jìn)而參加各種免疫反應(yīng)[15]。且TNF-α與神經(jīng)功能有關(guān)，可能在神經(jīng)損傷中起主導(dǎo)作用[16]。研究[16-18]表明，IL-6、TNF-α 與椎間盤(pán)退變密切相關(guān)，其表達(dá)水平與椎間盤(pán)退變呈正相關(guān)趨勢(shì)。本研究結(jié)果則顯示，模型組、推拿組椎間盤(pán)組織中 IL-6、TNF-α的分泌量明顯高于空白組，推測(cè)IL-6、TNF-α參與椎間盤(pán)的退變；且推拿組分泌量明顯低于模型組，推測(cè)推拿可通過(guò)減少I(mǎi)L-6、TNF-α的分泌量而緩解椎間盤(pán)退變。

TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子, 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。且研究[19]顯示，TGF-β1 在退變椎間盤(pán)組織的表達(dá)明顯升高。而TGF-β1的表達(dá)量和腰椎間盤(pán)退行性病變的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[20]。Tran等[21]證實(shí)， TGF -β1 通過(guò) Smad3/AP-1 通路調(diào)節(jié)椎間盤(pán)髓核內(nèi) CTGF 的表達(dá)，且退變椎間盤(pán)中的 CTGF 含量比正常者高。有研究[22]顯示，軟骨細(xì)胞中CTGF可促進(jìn)蛋白多糖、Ⅱ型膠原的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)合成并抑制凋亡。且研究[23]證實(shí)，腰椎間盤(pán)中TGF-β1及TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子水平隨著病情加重呈顯著增高趨勢(shì)，TGF-β1與TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子均呈顯著正相關(guān)，同時(shí)TGF-β1與椎間盤(pán)退變程度呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組、推拿組椎間盤(pán)組織中TGF-β1、CTCF的分泌量明顯高于空白組，推測(cè) TGF-β1、CTGF參與椎間盤(pán)的退變；且推拿組分泌量明顯低于模型組，推測(cè)推拿組腰椎間盤(pán)退變程度低于模型組。

綜上所述，本研究證實(shí)了TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF與腰椎間盤(pán)退變密切相關(guān)，且推拿組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量均降低，推測(cè)推拿可減緩腰椎間盤(pán)退變，且TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量可能與椎間盤(pán)退變程度呈正相關(guān)。而推拿作用機(jī)理可能與抑制炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量相關(guān)。上述因子的檢測(cè)對(duì)推拿治療腰椎間盤(pán)退行性疾病有著重要的意義，但細(xì)胞因子間的相互作用對(duì)腰椎間盤(pán)退變的影響仍需進(jìn)一步研究。