Box-Behnken模型響應(yīng)面法優(yōu)化口蘑酸奶發(fā)酵工藝

楊帆，李楓，楊凱瑜

（福州大學(xué)至誠學(xué)院，福州350002）

0 引言

食用菌營養(yǎng)豐富已成為人類的第三大食物來源，并起到較好的食療功效被廣泛應(yīng)用到食品行業(yè)中[1-3]?？谀ⅲ═richoloma mongolicum Imai）近年來逐漸走入人們的視野，其富含大量礦物元素尤以硒元素為首，僅次于靈芝被譽(yù)為“抗癌之王”[4]。因而，口蘑也經(jīng)常被添加到食品中作為功能食品開發(fā)的不二之選，例如，莜面馬鈴薯口蘑餅干[5]、口蘑黃酮富硒飲料[6]、褐口蘑蜜餞[7]等。酸奶早已成為整個(gè)新生代和健康人群首選佳品[8]，如百香果酸奶[9]、大豆酸奶[10]等。將口蘑添加到酸奶中，研制出一款口蘑酸奶，不僅較水果酸奶蛋白含量豐富，且微量元素更勝大豆酸奶，為口蘑綜合開發(fā)利用開辟一條新的途徑，也為食用菌在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供思路和參考。本文結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化口蘑酸奶工藝，響應(yīng)面法可將響應(yīng)值受多個(gè)因素影響的問題建模分析，便捷地與隨機(jī)仿真和確定性仿真問題結(jié)合起來，因而越來越多的被應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，尤其是食品工業(yè)[11]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉，市售鮮口蘑，惠宜白砂糖，尚川優(yōu)養(yǎng)酸奶發(fā)酵菌（嗜熱鏈球菌、雙歧兩歧桿菌TMC3115，德氏乳桿菌保加利亞亞種）。

V-5600型可見分光光度計(jì)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，ZCZY-CS8型搖床。

1.2 方法

1.2.1 口蘑酸奶制備(1工藝流程。

(2)口蘑汁的制備。取新鮮口蘑30 g，加90 mL蒸餾水榨汁，混勻過濾制得口蘑汁。

(3)復(fù)原乳制備。取16 g乳粉加入200 mL蒸餾水，將白砂糖按比例加入，溶解后放入-4℃冰箱備用。(4)均質(zhì)、殺菌。將口蘑汁和復(fù)原乳按比例混合（不扣除口蘑自身含水量），放入均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，充分溶解后加熱至90℃，并保持15 min。

(5)接種、去沫、灌裝、發(fā)酵。殺菌后的混合乳快速冷卻至40℃，然后在無菌操作臺(tái)上按比例加入發(fā)酵劑，混勻后去沫，攪拌均勻后分裝在酸奶杯中，封口，42℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵24 h。

(6)冷卻后熟。發(fā)酵結(jié)束后在室溫下冷卻20 min，-4℃冷藏至少4 h以上。

1.2.2 感官評(píng)定

依據(jù)表達(dá)力、準(zhǔn)時(shí)性、對(duì)試樣態(tài)度及健康狀況等篩選福州大學(xué)至誠學(xué)院10名學(xué)生作為評(píng)分員（18～24歲，7女3男）進(jìn)行為期3個(gè)月的酸奶感官評(píng)定[12]訓(xùn)練。每日選取同一時(shí)間段（15:00～16:00）評(píng)分，評(píng)分當(dāng)天評(píng)分員需至少空腹3 h，并用純凈水漱口3次。被評(píng)酸奶樣品統(tǒng)一用無色透明玻璃杯（200 mL）盛放100 mL。參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[13]適當(dāng)修改，對(duì)口蘑酸奶的色澤10分、香氣20分、組織形態(tài)35分、滋味35分進(jìn)行感官評(píng)定，見表1，去除一個(gè)最高分和一個(gè)最低分，取平均值作為最后感官評(píng)分?jǐn)?shù)。

表1感官評(píng)定指標(biāo)

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

考察口蘑汁添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）；白砂糖添加量（20，40，60，80，100 g/L，下同）；發(fā)酵劑添加量（10，20，30，40，50 g/L）。兩組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以口蘑汁添加量、白砂糖添加量、發(fā)酵劑添加量三因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]，以感官評(píng)定分值為響應(yīng)指標(biāo)。通過Desigin expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測口蘑酸奶最佳工藝參數(shù)，見表2。

表2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

結(jié)果分析采用響應(yīng)面軟件Box-Behnken模型設(shè)計(jì)分析，Sigmaplot Graph作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 口蘑汁添加量對(duì)感官評(píng)定的影響

對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，口蘑汁添加量對(duì)感官評(píng)定分值的影響差異較大。感官評(píng)定的分值隨口蘑汁添加量的增加先增大后降低，口蘑汁添加量在12%時(shí)，感官評(píng)定值達(dá)到最大78.8分，之后隨口蘑汁添加量增大而下降如圖1所示。由于口蘑有些許腥味[14]，添加量超過12%會(huì)使口蘑酸奶腥味加重，添加量過低會(huì)影響口蘑酸奶營養(yǎng)價(jià)值。因此，口蘑汁添加量在10%～14%之間最為合適。

圖1口蘑汁添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

2.1.2 白砂糖添加量對(duì)感官評(píng)定的影響

固定口蘑汁添加量12%，感官評(píng)定的分值隨口蘑汁添加量的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。在白砂糖添加量60 g/L時(shí)，感官評(píng)定分值達(dá)到最高為81.9分。當(dāng)白砂糖添加量達(dá)到100 g/L時(shí)，口蘑酸奶感官評(píng)定分值略有增加，可能是甜度過高影響味蕾[15]，導(dǎo)致滋味分值略有增高，同時(shí)，白砂糖添加量過多，口蘑酸奶香氣更濃，此項(xiàng)評(píng)分也略高。白砂糖添加量低于20 g/L時(shí)，口蘑酸奶的甜度不足，影響酸奶滋味，而超過100 g/L，口蘑酸奶甜度過高，口感會(huì)甜膩[15]。因此，白砂糖添加量選在40～80 g/L之間。

2.1.3 發(fā)酵劑添加量對(duì)感官評(píng)定的影響

將嗜熱鏈球菌、雙歧兩歧桿菌TMC3115及德氏乳桿菌保加利亞亞種按質(zhì)量比1∶2∶1混合[16]，可以起到互補(bǔ)作用，在發(fā)酵過程中可以相互促進(jìn)[17-18]。在固定口蘑汁添加量12%，白砂糖添加量60 g/L條件下，口蘑酸奶感官評(píng)定分值隨發(fā)酵劑添加量的增加而緩慢升高，添加量為30 g/L時(shí)，感官評(píng)定分值最高達(dá)85.0分，此后感官評(píng)定分值緩慢下降。因此，發(fā)酵劑添加量以30 g/L為宜。發(fā)酵劑添加量低于10 g/L酸奶發(fā)酵不充分，而超過50 g/L會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過度，不利于酸奶保存[19]。則發(fā)酵劑添加量應(yīng)選在20～40 g/L之間。

圖2白砂糖添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

圖3發(fā)酵劑添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化口蘑酸奶發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及二次多項(xiàng)式回歸模型建立

實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（見表3），并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出回歸方程為

2.2.2 方差分析和二次元回歸方程擬合

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜rob＞F(a)值，表明該模型極其顯著，（見表3）；軟件分析得到模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9910，=0.9794，大于0.9且接近于1，說明模型相關(guān)度很好[20]；變異系數(shù)(CV)為0.74，該值較低小于1（見表4），反映了此模型的置信度較高，說明此模型方程能很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，因此可以使用此模型來分析響應(yīng)值的變化[21]。預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率通常用模型失擬項(xiàng)表示[22]，此模型失擬項(xiàng)P=0.2295（＞0.05），說明失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)口蘑酸奶的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測，見表3。

回歸方程(1)中x2，x1x3，x12，x22，x32對(duì)口蘑酸奶感官品質(zhì)的影響極顯著（P＜0.01），x1、x3、x1x2對(duì)口蘑酸奶感官品質(zhì)的影響顯著（P＜0.05），而x2x3對(duì)口蘑酸奶感官品質(zhì)的影響不顯著（P＞0.05）說明發(fā)酵劑和白糖添加量交互作用較小，見表3，這可能與發(fā)酵菌株對(duì)底物糖類物質(zhì)的依賴性較低有關(guān)[18]。優(yōu)化回歸模型得回歸方程為

表3口蘑酸奶Box-Behnken模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

可見，口蘑汁、發(fā)酵劑和白砂糖添加量對(duì)口蘑酸奶色澤、香氣、組織形態(tài)、滋味影響影響較大。

表4二次回歸模型的方差分析結(jié)果

2.2.3 交互作用分析

為進(jìn)一步明晰各因素間的交互作用及確定最佳點(diǎn)，繪制響應(yīng)曲面圖及其投影而成的等高線圖，通過觀察三維曲面圖的傾斜程度、等高線的形狀和密集程度來剖析各因素對(duì)感官評(píng)分結(jié)果的影響以及兩兩因素間的交互作用。曲面坡度越陡峭，影響越顯著；坡度越平坦，影響越不顯著。橢圓和等高線疏離表明交互作用越顯著；圓形和等高線密集表明交互作用越不顯著[23]。

圖4口蘑汁和白砂糖添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

圖5口蘑汁和發(fā)酵劑添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

固定發(fā)酵劑添加量30 g/L，口蘑汁和白砂糖添加量兩因素的響應(yīng)面三維圖傾斜程度較大（圖4(a)），等高線近似呈現(xiàn)橢圓形（圖4(b)），說明兩個(gè)因素的影響顯著，兩因素交互作用顯著（P＜0.05）[24]?？谀⑺崮痰母泄僭u(píng)定分?jǐn)?shù)隨口蘑汁和白砂糖添加量增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，口蘑汁添加量軸向等高線更為稀疏，白砂糖添加量軸向等高線相對(duì)密集，說明兩因素變化時(shí)，口蘑汁對(duì)感官評(píng)定分值的影響相對(duì)較大（圖4(b)）。此外，響應(yīng)曲面圖開口向下，表明在實(shí)驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，在口蘑汁添加量12%～13%、白砂糖添加量50～70 g/L內(nèi)為最佳水平范圍。

圖6發(fā)酵劑和白砂糖添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分值的影響

固定白砂糖添加量30 g/L，口蘑汁和發(fā)酵劑添加量兩因素的響應(yīng)面三維圖傾斜程度較陡峭（圖5(a)），等高線呈橢圓形（圖5(b)），說明兩個(gè)因素的影響極顯著，兩因素交互作用極顯著（P＜0.01）[24]?？谀⑺崮痰母泄僭u(píng)定分值隨口蘑汁和發(fā)酵劑添加量的增加先升高后下降，口蘑汁添加量軸向等高線更為稀疏，發(fā)酵劑添加量軸向等高線相對(duì)密集，說明兩因素變化時(shí)，口蘑汁對(duì)感官評(píng)定分值的影響相對(duì)較大（圖5(b)）。此外，響應(yīng)曲面圖開口向下，表明在實(shí)驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，在口蘑汁添加量12%～13%、發(fā)酵劑添加量30～40 g/L內(nèi)為最佳水平范圍。

固定口蘑汁添加量12%，發(fā)酵劑和白砂糖添加量兩因素的響應(yīng)面三維圖傾斜程度較?。▓D6(a)），等高線近似呈圓形（圖6(b)），說明兩個(gè)因素的影響不顯著，兩因素交互作用不顯著（P＞0.05）[24]。口蘑酸奶的感官評(píng)定分值隨口蘑汁和白砂糖添加量的增加呈先升后降的趨勢，白砂糖和發(fā)酵劑的添加量軸向等高線都較為密集，說明兩因素對(duì)感官評(píng)定分值的影響都相對(duì)較?。▓D6(b)）。此外，響應(yīng)曲面圖開口向下，表明在實(shí)驗(yàn)所選范圍內(nèi)存在極大值，在發(fā)酵劑添加量30～40 g/L、白砂糖添加量50～70 g/L內(nèi)為最佳水平范圍。

綜上所述，兩因素交互作用的影響顯著性由大到小為：口蘑汁和發(fā)酵劑添加量交互作用＞口蘑汁和白砂糖添加量交互作用＞發(fā)酵劑和白砂糖添加量交互作用。

2.3 最佳工藝確定與驗(yàn)證

口蘑汁、白砂糖和發(fā)酵劑添加量對(duì)口蘑酸奶的感官評(píng)定分值顯著影響，經(jīng)模型預(yù)測可得最佳工藝條件為：口蘑汁添加量12.26%，白砂糖添加量64 g/L，發(fā)酵劑添加量33.2 g/L，口蘑酸奶的感官評(píng)定分值模型預(yù)測值為88.76分。便于實(shí)驗(yàn)操作，修訂工藝條件為：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，發(fā)酵劑添加量33 g/L，在此條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得實(shí)際口蘑酸奶的感官評(píng)定分值為(88.93±0.37)分，與預(yù)測值偏離在0.19%左右。

3 結(jié)論

以感官評(píng)定分值為指標(biāo)，利用響應(yīng)面的Box-Behnken模型研究了口蘑汁、白砂糖和發(fā)酵劑添加量對(duì)口蘑酸奶感官評(píng)定分?jǐn)?shù)的影響,建立二次多項(xiàng)式模型（P＜0.001），在分析預(yù)測最優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最終獲得優(yōu)佳工藝：蘑汁添加量12.3%，白砂糖添加量64 g/L，發(fā)酵劑添加量33 g/L，口蘑乳酸菌酸奶的感官評(píng)定分?jǐn)?shù)(88.93±0.37)分。所得產(chǎn)品奶香濃郁并散發(fā)口蘑獨(dú)特的香味，口感絲滑鮮美，則應(yīng)用響應(yīng)面法研究食用菌乳酸菌酸奶工藝是切實(shí)可行的，且為食用菌的開發(fā)和利用提供新的思路和參考。