微滴數(shù)字PCR定量檢測乳制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

程逸宇，馮秋實(shí)，吳海晶，黃夢靜，劉新梅

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京211198）

0 引 言

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一種常見的食源性致病菌[1-2]。世界衛(wèi)生組織指出，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可能污染蔬菜、乳制品、肉制品等常見食品[3]，特別在乳制品中普遍存在[4]。我國對食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測采用培養(yǎng)法[5]，檢驗(yàn)周期較長，需要6～7 d才能完成，不能滿足乳制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌快速檢測的需求[6]。微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)是新型核酸定量檢測技術(shù)[7]。該方法在PCR前將含有核酸的反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，使大部分微滴中的DNA分子數(shù)為1或0，依據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)[8]，實(shí)現(xiàn)核酸絕對定量分析[9]。建立單核細(xì)胞增生李斯特氏菌dd PCR檢測方法，對乳制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速定量檢測具有重大意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、英諾克李斯特氏菌（CICC21671）、伊氏李斯特氏菌（CICC21663）、斯氏李斯特氏菌（CICC10417）。

1.1.2 材料與試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、qPCR擴(kuò)增預(yù)混液Premix Ex Taq(Takara)；dd PCR擴(kuò)增預(yù)混液dd PCR Super mix for Probes（Bio-Rad）；引物、探針；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；TSA-YE培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯。

1.1.3 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，QX 200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，T 100 PCR儀，CFX 96 Touch熒光PCR儀，冷凍高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

用接種環(huán)沾取甘油管保存的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液，在胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)平板上劃線，于37°C培養(yǎng)16 h。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用，采用GB4789.30-2016平板計(jì)數(shù)法[10]檢測菌液濃度。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取及引物和探針設(shè)計(jì)

取體積為1 mL菌液，采取Takara細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，洗脫到100μL TE緩沖液中。參考SN/T 1870-2016[11]，以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌iap基因?yàn)榘谢?，合成引物探針，如?。1

表1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PCR引物和探針序列

1.2.3 qPCR和dd PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

qPCR反應(yīng)體系(25μL)：12.5μL buffer；濃度為10μmol/L上、下游引物各1μL；濃度為10μmol/L探針0.5μL；模板DNA 1μL；用ddH 2O補(bǔ)至25μL。qPCR反應(yīng)條件為95°C，3 min；94°C，5 s，60°C，40 s(收集FAM熒光)，40個(gè)循環(huán)。

dd PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1.8μL（濃度900 nmol/L），探針0.5μL（濃度250 nmol/L），dd PCR Super mix for Probes 10μL，DNA模板1μL，加dd H 2O至20μL。利用Bio-Rad QX 100數(shù)字PCR微滴生成儀將20μL體系混合物生成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。dd PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，98℃微滴固化10 min后，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后利用Bio-Rad QX 200微滴分析儀讀取DNA拷貝數(shù)。

1.2.4 dd PCR檢測方法特異性驗(yàn)證

分別挑取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、大腸埃希氏菌至營養(yǎng)肉湯中，37°C培養(yǎng)16 h，提取DNA，采用

1.2.3 條件進(jìn)行dd PCR檢測。

1.2.5 dd PCR和qPCR檢測方法線性范圍

將1.2.2制得的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到終濃度分別為107，106，105，104，103，102，10，1拷貝數(shù)/mL的樣品，標(biāo)記為S7-S0。樣品取1μL作為模板DNA進(jìn)行dd PCR和qPCR檢測，每個(gè)梯度做3次平行檢測。

1.2.6 人工污染巴氏乳檢測

選取市售巴氏乳，加入1.2.1培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌液，梯度稀釋，制得含菌量為5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102，50 mL-1的人工污染巴氏乳樣品。提取樣品中細(xì)菌DNA，采用qPCR法和dd PCR法分別進(jìn)行檢測，每一樣品進(jìn)行三次重復(fù)，比較兩種檢測方法的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）及可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 dd PCR檢測方法特異性

dd PCR對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DNA擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。DNA擴(kuò)增效果良好，其中陽性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇(圖1a)，而且中間彌散的微滴數(shù)目很少；直方圖(圖1b)中陽性峰和陰性峰顯著分開，中間沒有任何干擾，表明ddPCR引物探針和

擴(kuò)增體系適合對單增李斯特氏菌進(jìn)行定量分析。

圖1 ddPCR方法擴(kuò)增單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用李斯特氏菌屬4種菌株（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌）和常見菌大腸埃希氏菌進(jìn)行dd PCR檢測方法特異性驗(yàn)證。只有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌得到特異性擴(kuò)增，其他菌株均為陰性反應(yīng)，無特異性擴(kuò)增，如圖2，表明單核細(xì)胞增生李斯特氏菌dd PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖2 ddPC檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌方法特異性實(shí)驗(yàn)

2.2 dd PCR和qPCR檢測方法線性范圍

將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DNA提取液梯度稀釋，制得DNA濃度為107～1拷貝數(shù)copies/mL的樣品，標(biāo)記為S7-S0，進(jìn)行dd PCR和qPCR檢測。所有dd PCR反應(yīng)生成的微滴數(shù)目均大于10 000，表明所有反應(yīng)微滴生成正常，保證了后續(xù)定量分析的準(zhǔn)確性。S7至S0樣品中，dd PCR產(chǎn)生的陽性微滴數(shù)目隨著模板DNA濃度降低而降低。在S7中，陽性微滴數(shù)與微滴總數(shù)接近，表明所有的微滴都有模板DNA分子分布，該濃度下所有微滴均被DNA飽和，無陰性微滴存在，不滿足泊松分布，定量結(jié)果顯著偏離真實(shí)值，無法實(shí)現(xiàn)dd PCR的準(zhǔn)確定量。而在S0中，因模板DNA濃度過低導(dǎo)致沒有陽性微滴生成，檢測結(jié)果為陰性，無特異性擴(kuò)增如圖3所示。實(shí)驗(yàn)表明，S6-S1這6個(gè)樣品均適合dd PCR擴(kuò)增，能計(jì)算出模板DNA濃度，表明dd PCR的檢測范圍是106～10拷貝數(shù)/m L，最低檢出限為10拷貝數(shù)/mL。根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品DNA濃度在106～10拷貝數(shù)/mL之間時(shí)dd PCR檢測結(jié)果呈良好的線性關(guān)系R2=0.9996，適合定量檢測的需要，如圖4。

圖3 ddPCR各樣本生成的微滴數(shù)

圖4單增李斯特氏菌ddPCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

qPCR檢測結(jié)果顯示，qPCR可對S7-S3樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線正常，如圖5，而對S2，S1和S0這三個(gè)樣品無法檢出。這說明qPCR最低檢出限為103拷貝數(shù)/mL，檢測靈敏度低于dd PCR。將測得C t代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度值作圖，qPCR線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9980，如圖6。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，dd PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性和最低檢出限均優(yōu)于qPCR檢測，表明dd PCR和qPCR相比具有更高的準(zhǔn)確度和靈敏度。

2.3 人工污染乳制品檢測

對不同菌量污染的巴氏乳進(jìn)行dd PCR和qPCR檢測，結(jié)果如表2所示。ddPCR檢測人工染菌巴氏乳，當(dāng)樣品含菌量為5×107CFU/mL時(shí)陽性液滴過飽和，無法讀出準(zhǔn)確數(shù)值。樣品含菌量在5×103～5×106CFU/mL之間時(shí)dd PCR檢測結(jié)果與理論添加值吻合度較高。食品法典(CAC)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，當(dāng)檢出率≥95%時(shí)為最低檢測下限（LOD），當(dāng)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤25%時(shí)為定量檢測下限（LOQ）[12]。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，樣品含菌量在5×102CFU/mL時(shí)dd PCR檢出率≥95%但RSD≤25%，因此該檢測方法的LOD和LOQ分別為5×102CFU/mL和5×103CFU/m L。qPCR檢測能對含菌量在5×107～5×103CFU/mL之間樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的結(jié)果重復(fù)性較差，且與理論添加值有較大誤差。由此可見，dd PCR檢測方法在檢測靈敏度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性上均優(yōu)于qPCR檢測方法。

圖5單增李斯特氏菌qPCR檢測

圖6單增李斯特氏菌qPCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2檢測人工污染巴氏乳中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

比較2.2與2.3中dd PCR檢測結(jié)果可知，dd PCR檢測巴氏乳中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的靈敏度遠(yuǎn)低于直接檢測該菌DNA提取液?？赡軐?dǎo)致這一結(jié)果的原因?yàn)?，?xì)菌DNA提取試劑盒提取低濃度細(xì)菌DNA時(shí)得率較低，從而使得檢測靈敏度降低。由此可見，高效提取樣品中低濃度細(xì)菌DNA是提高dd PCR檢測方法靈敏度的關(guān)鍵。

3 結(jié) 論

乳制品是人體受單核細(xì)胞增生李斯特氏菌侵染的主要感染源，加強(qiáng)對乳制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測尤其重要。目前常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法操作簡單，但是耗時(shí)長，不能滿足致病菌檢測快速、靈敏的需要，不適用于大規(guī)?？焖贆z測。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，研究人員開發(fā)出實(shí)時(shí)熒光PCR法（qPCR）[13]、熒光染色法[14]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[15]等多種快速檢測方法。qPCR法具有方便快捷、靈敏度高[16]等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，但也存在重復(fù)性差、無法準(zhǔn)確定量等問題[17]。dd PCR作為一種新的定量檢測技術(shù)已廣泛運(yùn)用到致病菌檢測中[18]。周巍等[19]建立了發(fā)酵乳中dd PCR技術(shù)定量檢測金黃色葡萄球菌的方法，檢測特異性良好，檢測靈敏度為3.3×101CFU/g。本研究實(shí)驗(yàn)運(yùn)用dd PCR技術(shù)對乳制品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測與精確定量。dd PCR方法簡便快速，具有較好的特異性，能對乳制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定。ddPCR檢測方法對巴氏乳中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最低檢出限（LOD）為5×102CFU/mL，定量限（LOQ）為5×103CFU/mL，滿足快速定量檢測的要求。本方法與qPCR方法相比，具有靈敏度高、精密度高、可重復(fù)性好、檢測低濃度染菌樣品更精確等優(yōu)點(diǎn)，適合在乳制品企業(yè)及食品檢測機(jī)構(gòu)中推廣運(yùn)用。