構(gòu)建小型豬慢性阻塞性肺疾病合并早期肺心病的模型*

楊 智,付 兵,李春平,李 睿,楊 帆,楊大興,王文斌

(1.四川省成都市第五人民醫(yī)院放射科 611130；2：川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川南充 637000)

有研究表明，我國每年有將近100多萬慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者死亡，同時COPD也位于我國疾病負擔(dān)的第2位[1]。COPD合并肺源性心臟病(肺心病)是COPD疾病發(fā)展的必然進程和最終結(jié)局，也是嚴(yán)重降低患者勞動能力、生活質(zhì)量及致死的最重要因素[2]。雖然對COPD合并肺心病目前進行了較多的研究，但是部分發(fā)病機制及疾病的相關(guān)預(yù)防和治療至今未被完全闡明。因此，建立符合人類病因及病程發(fā)展、且能完成臨床治療與隨訪的COPD合并早期肺心病的動物模型一直是國內(nèi)外學(xué)者追求的目標(biāo)和努力的方向[3]。本實驗主要從肺功能、心臟磁共振成像、病理切片等方法測定肺總量、功能殘氣量、吸氣氣道阻力、呼氣氣道阻力、右心室舒張末期質(zhì)量、右心室舒張末期容積、肺組織及心肌細胞的組織學(xué)改變，來探討反復(fù)氣管內(nèi)滴注木瓜蛋白酶和胰蛋白酶建立COPD合并早期肺心病小型豬模型方法的可靠性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取小型豬15頭為造模組，由川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，其中雄性10頭，雌性5頭，體質(zhì)量20～30 kg，豬齡8～9個月。

1.2方法

1.2.1建立COPD合并早期肺心病模型 實驗第1周制備COPD合并早期肺心病模型方法：星期二在所有小型豬麻醉前30 min肌肉注射阿托品(0.4 mg/kg)，隨后于頸部肌肉注射地西泮20 mg，待小型豬安靜后，于小型豬耳緣靜脈建立靜脈通道，經(jīng)通道分3次注入氯胺酮(20 mg/kg)及異戊巴比妥鈉(80 mg/kg)進行麻醉，麻醉滿意后將其固定于特定的動物支架上，然后對小型豬進行氣管內(nèi)插管，將木瓜蛋白酶6 U/kg稀釋成20 mL的生理鹽水經(jīng)氣管插管內(nèi)注入；星期五重復(fù)上述小型豬麻醉及固定方法將胰蛋白酶300 U/kg稀釋成20 mL生理鹽水注入氣管內(nèi)。實驗第2～20周重復(fù)上述第1周的造模方法。所有實驗動物均喂養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，小型豬飼料及飲用水由動物實驗中心供應(yīng)。

1.2.2小型豬肺功能測定與心臟磁共振檢查 于造模的第0～20周每周六重復(fù)上述麻醉，麻醉后采用AniRes2003動物肺功能分析系統(tǒng)(中國北京貝蘭博科技有限公司生產(chǎn))來測定造模小型豬的肺總量(TLC)、功能殘氣量(FRC)、吸氣氣道阻力(Ri)、呼氣氣道阻力(Re)。造模小型豬肺功能測定完成后，將麻醉的小型豬轉(zhuǎn)運入川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科進行心臟磁共振掃描，并測定右心舒張末期容積及右心舒張末期質(zhì)量，具體掃描及測定方法見文獻[4-5]。

1.2.3病理標(biāo)本的采取及處理方法 將死亡的造模小型豬的肺、心臟組織常規(guī)采用4%甲醛進行組織固定，然后常規(guī)脫水、包埋、蘇木精-伊紅(HE)染色、制成石蠟切片，于光鏡下觀察肺組織及心臟的病理形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1造模小型豬一般情況 造模第5周末造模小型豬死亡2頭，死亡原因為造模后肺部出現(xiàn)感染。造模第11周末死亡2頭，死亡原因為造模過程中引起急性大咯血窒息。造模第16周末死亡1頭，死亡原因為急性肺部感染。造模第20周末完成實驗后死亡4頭，為麻醉后的肺部嚴(yán)重感染。造模前小型豬平均體質(zhì)量為(27.0±1.31)kg，造模后第5、20周造模小型豬平均體質(zhì)量分別為(28.1±2.41)、(29.5±1.78)kg，造模小型豬造模前后體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模第5周開始出現(xiàn)夜間咳嗽、呼吸困難等癥狀。

2.2造模小型豬肺組織及心臟細胞病理學(xué)改變 第5周末造模小型豬肺組織表面見血點、肺表面凹凸不平，HE染色發(fā)現(xiàn)造模小型豬第5周末肺組織內(nèi)肺泡擴大，肺泡壁斷裂，肺間隔水腫；造模第20周對死亡小型豬心臟組織進行HE染色發(fā)現(xiàn)右心室心肌細胞肥大，乳頭肌肥大，見圖1、2。

A：大體觀察造模小型豬雙肺有陳舊性出血點，肺表面凹凸不平；B：外周肺泡間隔破壞，肺泡腔明顯擴大

A：局部心肌細胞肥大；B：橫斷面示心肌細胞增粗

2.3造模小型豬肺功能指標(biāo)變化 造模第5、20周末肺功能與造模前小型豬肺功能比較，造模小型豬造模后TLC、FRC、Ri、Re均較造模前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 造模小型豬造模前與造模第5周末肺功能比較

表2 造模小型豬造模前與造模第20周末肺功能比較

2.4造模小型豬右心功能指標(biāo)變化 造模小型豬造模第20周右心室舒張末期容積減小、右心室射血分?jǐn)?shù)較造模前降低，右心室舒張末期質(zhì)量較造模前增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 造模小型豬造模前與造模第20周末右心室結(jié)構(gòu)及功能比較

3 討 論

COPD是引起肺心病的最常見的原因，其導(dǎo)致原發(fā)性肺心病的病理生理學(xué)機制主要為：COPD導(dǎo)致的人體缺氧，繼發(fā)肺小血管收縮、痙攣、肺小動脈阻力增加，引起右心后負荷增大、右心室肌肥大，最終導(dǎo)致右心心力衰竭發(fā)生[1,6]。目前的研究認(rèn)為早期發(fā)現(xiàn)COPD繼發(fā)肺動脈高壓后右心結(jié)構(gòu)及功能的改變，有助于早期治療方案的確定[7-8]；同時COPD合并早期肺心病動物模型的建立對疾病的發(fā)病機制及診療方式的探討，以及新藥的開發(fā)有著非常重要的作用。目前木瓜蛋白酶能誘導(dǎo)COPD模型已經(jīng)被證實，但是其造模所用的動物均為鼠、兔等小動物，缺乏COPD繼發(fā)早期肺心病的大型動物造模研究，大型動物的造模有助于外科手術(shù)治療及治療后應(yīng)用無創(chuàng)性檢查儀器進行療效觀察研究[9]。

本實驗采用木瓜蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶誘導(dǎo)小型豬COPD繼發(fā)早期肺心病的實驗?zāi)Ｐ蚚10]。氣管內(nèi)注入木瓜蛋白酶，會引起小型豬肺泡腔擴大，肺泡間隔斷裂的肺氣腫征象，同時聯(lián)合胰蛋白酶能使肺內(nèi)彈性蛋白酶/抗彈性蛋白酶系統(tǒng)失衡、激活肺組織內(nèi)彈性蛋白酶活性，另外胰蛋白酶還能分解肺內(nèi)的彈性蛋白、纖維粘連蛋白，使肺的彈性功能降低、順應(yīng)性減低，導(dǎo)致呼氣性呼吸困難，加速COPD進展[11]。本實驗同時也證實木瓜蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶誘導(dǎo)小型豬COPD模型是可行的。本研究期望降低小型豬COPD的建模時間，反復(fù)向小型豬氣管內(nèi)注入木瓜蛋白酶及胰蛋白酶，但是出現(xiàn)明顯功能受損是在第5周，這可能與小型豬、犬類等大型動物肺體積較大，以及肺組織發(fā)育較為完善有關(guān)[12]。隨著造模時間的推移，造模小型豬的肺功能受損更加嚴(yán)重，第20周末小型豬Re較造模第5周末明顯增加。這說明支氣管、肺組織反復(fù)發(fā)生炎癥損傷，以及持續(xù)的外基質(zhì)的沉積，加重了肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞及纖維化[13-14]。

COPD逐漸進展導(dǎo)致的肺動脈壓力增高，繼發(fā)右心室后負荷增大，最終導(dǎo)致肺心病及右心心力衰竭[15]。早期發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測、隨訪COPD患者右心室結(jié)構(gòu)及功能的改變對于COPD的治療有著非常重要的作用。小型豬的心臟結(jié)構(gòu)與人類類似，也利于治療后體外的隨訪觀察，成為COPD合并早期肺心病動物模型的首選。本實驗發(fā)現(xiàn)：小型豬在造模第20周末右心室舒張末容積降低，心肌肥大，右心室舒張末期質(zhì)量增加，右心室射血分?jǐn)?shù)降低，這符合人類COPD合并早期肺心病的病理表現(xiàn)。隨著COPD的進展，肺動脈壓力增大、右心后負荷增加，為保證右心射血功能正常，右心心肌出現(xiàn)代償性肥大，早期右心室容積縮小，隨后容積增大，心臟失代償，發(fā)生右心心力衰竭[16]。同時，本實驗也采用無創(chuàng)性體外檢查技術(shù)來監(jiān)測右心室結(jié)構(gòu)及功能變化，減輕了實驗動物的傷害，也同時為后續(xù)疾病的治療、隨訪提供了新的思路與方法。

綜上所述，木瓜蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶可誘導(dǎo)小型豬COPD合并早期肺心病模型的建立，能夠展現(xiàn)COPD及早期肺心病的特征，可以為進一步治療和預(yù)防COPD合并早期肺心病的研究提供一定的基礎(chǔ)。