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    微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的研究進(jìn)展

    2019-02-15 08:28:26朱晁誼朱牧孜
    生物加工過程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:易錯突變體宿主

    朱晁誼,朱牧孜,李 爽

    (1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006;2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070)

    近年來,隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展,通過基因工程及代謝工程構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)高附加值化合物變得極具吸引力。盡管微生物細(xì)胞工廠在化工、食品、制藥、醫(yī)療和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已取得諸多成果,如已處于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的1,4-丁二醇(1,4-butanediol)[1]和重要藥物前體青蒿酸(artemisinic acid)[2],但獲得適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的高產(chǎn)菌種仍是目前一大難題[3]。微生物細(xì)胞生長及生產(chǎn)往往涉及多種表型的協(xié)調(diào)優(yōu)化,受多個基因及環(huán)境因素相互作用的影響,即使以基因背景充分解析的微生物為宿主,依然存在許多不可預(yù)測的因素,限制了人們對微生物工廠的合理設(shè)計(jì)。因?yàn)槲⑸锲毡榫邆溥z傳與變異的進(jìn)化特性,所以讓微生物通過進(jìn)化自主完成系統(tǒng)表型優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高產(chǎn),是21世紀(jì)由石油化工向生物化工轉(zhuǎn)型過程中科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。

    1 微生物自適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化

    一般來說,微生物在適應(yīng)環(huán)境過程中,菌體必然會發(fā)生變異,改變某些表型,這是進(jìn)化的必然趨勢。在該理論的支持下,微生物自適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)應(yīng)運(yùn)而生。ALE是指通過施加人為干擾及控制微生物生長環(huán)境實(shí)現(xiàn)微生物進(jìn)化。與代謝工程相比,ALE不需要考慮菌體錯綜復(fù)雜、相互交叉的代謝網(wǎng)絡(luò),只需根據(jù)目標(biāo)設(shè)計(jì)對應(yīng)的干擾因素,具有微生物適用性廣泛及實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),易于發(fā)現(xiàn)新機(jī)制、實(shí)現(xiàn)表型優(yōu)化[4]。

    自20世紀(jì)末開始,越來越多的學(xué)者使用ALE技術(shù)改造菌株以實(shí)現(xiàn)所需的功能。Caspetal等[5]通過對S.cerevisiaeCEN.PK113-7D實(shí)行ALE實(shí)驗(yàn)以篩選耐熱性菌株,在39.5 ℃條件下連續(xù)傳代超過300代,最終突變株在40 ℃條件下的比生長速率提高了1.57倍,乙醇與甘油的產(chǎn)量分別提高了1.6和1.3倍。菌株全基因組測序及轉(zhuǎn)錄組測序分析表明,酵母耐熱性提高與固醇合成途徑某些基因的突變及表達(dá)增加有關(guān)。筆者所在的課題組的Zhu等[6]和Yang等[7]也曾利用ALE實(shí)驗(yàn)對2株經(jīng)代謝工程改造過的嗜熱厭氧桿菌T.aotearoenseSCUT27進(jìn)行了高濃度底物耐受進(jìn)化實(shí)驗(yàn),產(chǎn)乙醇突變株SCUT27/Δldh和產(chǎn)乳酸突變株LA1002分別在梯度增加碳源的培養(yǎng)基中經(jīng)過58和40次傳代;在5 L發(fā)酵罐研究中,突變株SCUT27/Δldh-G58比出發(fā)菌株的遲滯期縮短75 h,乙醇產(chǎn)量提高了1.6倍;LA1002-G40在48 h內(nèi)完全發(fā)酵含100 g/L糖的廚余水解液,乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)68.03 g/L和0.79 g/g,而LA1002未見生長。最后,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和胞內(nèi)溶質(zhì)研究顯示,高滲透壓環(huán)境促使嗜熱厭氧桿菌調(diào)控自身UDP-glucose代謝、氨基酸代謝等多個通路,使可作為滲透壓保護(hù)劑的谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)等氨基酸胞內(nèi)的含量增加了1.42~2.90倍,并上調(diào)了應(yīng)對環(huán)境壓力的DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。這充分說明了ALE實(shí)驗(yàn)在實(shí)現(xiàn)菌株定向進(jìn)化方面的便捷性和有效性。

    在具體實(shí)踐中,ALE實(shí)驗(yàn)以特定的選擇壓力為基準(zhǔn)篩選表型增強(qiáng)的突變體,多應(yīng)用于提高工業(yè)菌種在不同生產(chǎn)條件下的穩(wěn)定性及耐受性,如溫度耐受性[5]、離子液體耐受性[8]及有效利用次優(yōu)碳源[9]等。然而,在獲得高產(chǎn)化合物的進(jìn)化研究中,由于化合物的生產(chǎn)通常會加重細(xì)胞負(fù)擔(dān)或產(chǎn)生細(xì)胞毒性,這種傳統(tǒng)的ALE實(shí)驗(yàn)方法往往出現(xiàn)相反的結(jié)果[10]。因此,在提高化合物產(chǎn)量的進(jìn)化研究中,將目標(biāo)化合物的生產(chǎn)與微生物生長耦聯(lián)起來,是目前應(yīng)用ALE實(shí)驗(yàn)的一種有效方法。Reyes等[11]利用類胡蘿卜素具有抗氧化的特性,刪除了酵母細(xì)胞體內(nèi)正常清除活性氧(ROS)的途徑而使得類胡蘿卜素成為細(xì)胞抵御ROS的主要來源,通過周期性施加過氧化氫刺激的方法進(jìn)行ALE實(shí)驗(yàn),最終類胡蘿卜素產(chǎn)量提高約3倍。

    2 提高微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化速度的策略

    ALE實(shí)驗(yàn)可不需要預(yù)先產(chǎn)生目標(biāo)基因的突變庫,通過施加環(huán)境壓力促進(jìn)微生物進(jìn)化,但微生物自發(fā)突變率很低,需要通過長期傳代培養(yǎng)以富集突變。因此,為提高微生物進(jìn)化速度,通常需增加出發(fā)菌株的基因多樣性。

    基因多樣性可以通過多種方法產(chǎn)生,從完全無靶向的全基因組誘變到針對特定基因的完全靶向方法,皆有文獻(xiàn)報(bào)道。早期研究中,常使用增變菌株為宿主(如E.coliXL1-Red,其全基因組突變率為野生型菌株的5 000倍)[12],利用紫外誘變或化學(xué)誘變[13]構(gòu)建突變庫等方法建立基因多樣性,但其不穩(wěn)定性及無目的全靶向等弊端限制了其大范圍使用。

    近年來,比起完全無靶向的全基因誘變或?qū)δ康幕蛏钊肓私獾娜邢蛲蛔兎椒?,連續(xù)定向進(jìn)化方法更受廣大學(xué)者青睞,其最重要的一個特征是能以這一種不會擾亂宿主生長的方式調(diào)節(jié)目的基因進(jìn)行進(jìn)化[14]。以下介紹將突變局限于目標(biāo)基因的定向進(jìn)化方法(體外或體內(nèi)構(gòu)建突變體),很大程度地避免宿主其他基因的突變。

    2.1 體外構(gòu)建突變庫

    在體外采取隨機(jī)突變產(chǎn)生目的基因突變庫是一種較為有效的半靶向方法,如易錯傾向的PCR(error-prone PCR,epPCR)[15]。這種基于PCR的方法利用低保真DNA聚合酶可快速構(gòu)建基因突變庫,經(jīng)濟(jì)省時(shí),但低保真DNA聚合酶傾向于產(chǎn)生特定類型的突變,導(dǎo)致epPCR突變庫產(chǎn)生某種偏向性,縮小了突變庫的有效規(guī)模。目前,可以通過改變PCR反應(yīng)中dNTPs的比例或使用多種不同偏向的易錯DNA聚合酶來克服該缺點(diǎn)。此外,一些常規(guī)的體外構(gòu)建突變庫的方案,如DNA shuffling等可以詳細(xì)參考相關(guān)綜述[16]。

    近年來,體內(nèi)位點(diǎn)特異性突變及自動化技術(shù)的進(jìn)步為微生物持續(xù)定向進(jìn)化提供了機(jī)遇[17-18],在初步了解與表型相關(guān)基因組區(qū)域的情況下,這些方法可有效規(guī)避隨機(jī)突變的偏向性及不可控性等問題。

    Wang等[19]成功開發(fā)出多重自動化基因工程技術(shù)(multiplexed automated genome engineering,MAGE),如圖1(a)所示,通過單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)實(shí)現(xiàn)E.coli染色體上多位點(diǎn)的同時(shí)突變,實(shí)現(xiàn)基因組合多樣性。通過改造E.coli的限制修飾系統(tǒng),引入噬菌體的λ-Red ssDNA結(jié)合蛋白β,大大提高ssDNA的整合效率,并通過自動化裝置實(shí)現(xiàn)快速連續(xù)定向進(jìn)化。應(yīng)用這套系統(tǒng)優(yōu)化E.coliEcNR2的1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸鹽(DXP)合成途徑生產(chǎn)番茄紅素,針對DXP途徑中的24個基因,設(shè)計(jì)一系列特異性突變的ssDNA,利用MAGE技術(shù)連續(xù)隨機(jī)整合至宿主染色體,每天可創(chuàng)造超過43億個的突變體,并在3 d內(nèi)使番茄紅素產(chǎn)量提高超過5倍。MAGE技術(shù)自首次實(shí)現(xiàn)多基因位點(diǎn)的快速突變以來,目前已多次成功用于大腸桿菌的代謝途徑優(yōu)化[20-21],并有學(xué)者將此方法用于釀酒酵母中,演化出酵母寡聚核苷酸介導(dǎo)的基因工程技術(shù)(yeast oligo-mediated genome engineering,YOGE)[22]。

    CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic rep)系統(tǒng)的問世大大方便了生物基因組的靶向編輯,同時(shí)也被學(xué)者們研究發(fā)展應(yīng)用于定向進(jìn)化中。Ronda等[23]將CRISPR-Cas9與MAGE技術(shù)結(jié)合創(chuàng)造了CRMAGE技術(shù),將重組效率由0.68%~5.4%提高至96.5%~99.7%,大大提高了進(jìn)化效率。此外,Gill課題組的Garst等[24]開發(fā)了一套CRISPR激活的可追蹤基因工程技術(shù)(CRISPR-enabled trackable genome engineering,CREATE),如圖1(b)所示,該系統(tǒng)關(guān)鍵在于構(gòu)建包含gRNA與同源修復(fù)片段的CREATE表達(dá)盒,既完成位點(diǎn)突變,實(shí)現(xiàn)基因組的多樣性,也充當(dāng)追蹤標(biāo)記,篩選完成后快速發(fā)現(xiàn)基因型與表型間的聯(lián)系。此后,Gill課題組的Liang等[25]將此技術(shù)應(yīng)用于提高E.coli異源生產(chǎn)異丙醇中,在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下,不依賴全基因組測序,幾天內(nèi)生成并鑒定了近千個單基因和多基因組合突變體,最終獲得異丙醇產(chǎn)率提高3倍的E.coli突變菌株。

    2.2 體內(nèi)構(gòu)建突變庫

    前述的方法均是在ALE實(shí)驗(yàn)前獲得基因多樣性,如果能夠在ALE實(shí)驗(yàn)過程中獲得基因多樣性而不影響宿主菌株的正常生長,可簡化操作、減少人為干擾,更有利于實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化的連續(xù)性。

    2011年,Esvelt等[26]開發(fā)的噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化技術(shù)(phage-assisted continuous evolution,PACE)(圖2(a)),將目的蛋白活性與噬菌體的生命周期耦聯(lián),在恒化連續(xù)裝置的輔助下,8 d內(nèi)實(shí)現(xiàn)無人為干擾的目標(biāo)蛋白質(zhì)200代進(jìn)化。整套系統(tǒng)利用噬菌體M13的增殖依賴于pIII蛋白這一特性,將需進(jìn)化的目的基因替換原來的pIII蛋白基因,構(gòu)建1個含目的基因的pIII蛋白缺陷型的選擇噬菌體(selection phage,SP),而宿主E.coli則包含2個主要質(zhì)粒:輔助質(zhì)粒(accessory plasmid,AP)和致突變質(zhì)粒(mutagenesis plasmid,MP)。AP主要包含與目的基因活性相耦聯(lián)的pIII蛋白基因,SP必須進(jìn)化出有活性的突變,才可啟動AP上pIII蛋白表達(dá),噬菌體才可獲得增殖能力并持續(xù)侵染其他宿主,實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)化。而MP則含有4個dnaQ926、umuC、umuD′和recA730受阿拉伯糖調(diào)控的基因,經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生隨機(jī)突變,提高整個系統(tǒng)的突變率。此外,為了將作用于所有基因的隨機(jī)突變限制于噬菌體的目的基因處,他們引入恒化器裝置,流入新鮮的宿主細(xì)胞,并設(shè)置流出速度稍快于宿主的復(fù)制速度,故只有獲得有益突變從而完成增殖的噬菌體可以持續(xù)侵染新宿主,在恒化器中富集,而無法實(shí)現(xiàn)突變完成增殖的噬菌體則最終會流失。利用這套系統(tǒng)可進(jìn)化任何與pIII蛋白表達(dá)耦聯(lián)的蛋白,而目前將酶的多種功能與報(bào)告蛋白的表達(dá)相耦聯(lián)的研究進(jìn)展為PACE技術(shù)應(yīng)用于多種蛋白或酶的改造提供了可能。目前該技術(shù)已應(yīng)用于RNA聚合酶[27]、aminoacyl-tRNA合成酶[28]或毒素[29]等蛋白的進(jìn)化研究中。

    盡管PACE在連續(xù)定向進(jìn)化蛋白質(zhì)方面有突出的貢獻(xiàn),但目前它的宿主只限于大腸桿菌,無法用于酵母等真核生物。2016年,Crook等[30]建立了一套以轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)的酵母體內(nèi)定向進(jìn)化方法(invivocontinuous evolution,ICE)(圖2(b))。ICE系統(tǒng)的關(guān)鍵在于易錯傾向的Ty1逆轉(zhuǎn)錄酶。具體來說,整合至Ty1逆轉(zhuǎn)錄識別區(qū)域的目的基因首先被轉(zhuǎn)錄,接著易錯傾向的Ty1逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)并逆轉(zhuǎn)錄目的基因形成cDNA,產(chǎn)生基因多樣性之后,Ty1整合酶再將其重新整合至基因組上,完成一輪突變。這套利用逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行體內(nèi)誘變的系統(tǒng)可以擴(kuò)展到任何支持LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性的真核生物內(nèi),宿主應(yīng)用范圍廣泛,他們應(yīng)用這套系統(tǒng)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子SPT15對1-丁醇的耐受性,改變脫羧酶的底物特異性,提高木糖分解途徑通量,展示出ICE系統(tǒng)對轉(zhuǎn)錄因子、單酶甚至多酶途徑進(jìn)化的高效可行性。

    利用正交復(fù)制的突變質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)靶基因突變也是目前較受歡迎的一種方法,這種方法最大的特點(diǎn)就是幾乎不改變宿主基因組,不影響宿主的正常生長,適合于酶的進(jìn)化。這一策略最早期是由Fabret 等[31]在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn),他們利用DNA聚合酶Ⅰ(DNA PolⅠ)在細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先復(fù)制質(zhì)粒上的基因且只復(fù)制染色體一小部分的特點(diǎn),構(gòu)建低保真度的DNA PolⅠ突變體,完成質(zhì)粒基因的突變而不影響宿主基因。后來,Camp等[32]進(jìn)一步增強(qiáng)了DNA PolⅠ的錯配率,實(shí)現(xiàn)TEMβ-內(nèi)酰胺酶的連續(xù)進(jìn)化。除了在大腸桿菌中應(yīng)用,這種策略后來還被Liu Chang課題組的Ravikumar等[33-34]推廣至釀酒酵母的靶向突變中,他們在釀酒酵母中建立1個由正交DNA質(zhì)粒-DNA聚合酶對組成的細(xì)胞核外復(fù)制機(jī)制,并通過構(gòu)建易錯傾向的DNA聚合酶建立一套獨(dú)立于宿主的體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)(OrthoRep),其體內(nèi)質(zhì)粒突變率是宿主基因組的10萬倍(圖2(c))。此后,Ravikumar等[34]借助此系統(tǒng),在釀酒酵母中對惡性瘧原蟲來源的二氫葉酸還原酶(PfDHFR)進(jìn)行連續(xù)進(jìn)化,最終獲得對乙胺嘧啶耐受性提高4萬倍的突變體。最近,Liu Chang課題組的Arzumanyan等[35]對此系統(tǒng)進(jìn)一步發(fā)展,在1個細(xì)胞中構(gòu)建了pGKL1質(zhì)粒/TP-DNAP1聚合酶對與pGKL2質(zhì)粒/TP-DNAP2聚合酶對2個彼此正交的DNA復(fù)制系統(tǒng),這樣一對正交復(fù)制系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)2個聚合酶的錯配率,實(shí)現(xiàn)體內(nèi)多基因的不同速率的進(jìn)化。

    除了用于正交質(zhì)粒上的靶基因的連續(xù)進(jìn)化,將易錯傾向的DNA聚合酶用于基因組上任意靶基因的突變將更具應(yīng)用價(jià)值。最近,美國加州大學(xué)的Halperin等[36]將易錯DNA聚合酶與CRISPR技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了一種名為“EvolvR”的體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)(圖2(d))。該系統(tǒng)將只產(chǎn)生單鏈斷裂的nCas9蛋白突變體與易錯傾向的缺口DNA聚合酶突變體融合,由gRNA引導(dǎo)至特定靶序列,隨后nCas9蛋白切割產(chǎn)生單鏈缺口,易錯的DNA聚合酶從缺口處開始補(bǔ)上新的核苷酸,替換下游的核苷酸,對靶基因生成一系列突變體,在1 d內(nèi)完成整個進(jìn)化過程。一方面通過CRISPR系統(tǒng)規(guī)定了靶基因突變的起始位點(diǎn),并以多組gRNA的共表達(dá)實(shí)現(xiàn)對基因組上多個靶位點(diǎn)的同時(shí)進(jìn)化;另一方面通過調(diào)節(jié)DNA聚合酶突變體的持續(xù)合成能力、保真度及錯誤插入偏好性,從而相應(yīng)地控制靶基因的突變序列長度、突變率及核苷酸替代偏好,由此,理論上可實(shí)現(xiàn)所有物種的任意多個靶基因的體內(nèi)持續(xù)進(jìn)化。

    圖2 體內(nèi)構(gòu)建突變庫示意圖Fig.2 Schematic diagram of in vivo targeted mutagenesis

    將現(xiàn)有的微生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)化策略的詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)行總結(jié),見表1。

    3 連續(xù)自動化培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展

    事實(shí)上,不管是近年來發(fā)展迅猛的連續(xù)定向進(jìn)化策略還是早期依賴環(huán)境選擇壓力的適應(yīng)性進(jìn)化方法,皆是基于微生物連續(xù)繁殖、富集突變而獲得特定表型的進(jìn)化過程。微生物的連續(xù)培養(yǎng)繁殖主要是通過手動連續(xù)稀釋或自動化培養(yǎng)裝置實(shí)現(xiàn)的,前者容易出現(xiàn)種群瓶頸、培養(yǎng)密度波動及選擇壓力不均勻等問題;而后者的應(yīng)用卻常遇到生物膜積累、培養(yǎng)環(huán)境受限及高成本等阻礙,因此在推動微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的進(jìn)程中,連續(xù)自動化技術(shù)的發(fā)展尤為重要。

    為解決生物膜積累的問題,de Crecy等[37]開發(fā)了一種叫“Evolugator”的連續(xù)進(jìn)化裝置,在生物反應(yīng)器中設(shè)置不同隔離分區(qū),以與動態(tài)控制器相連的濁度計(jì)的測量值來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的循環(huán),達(dá)到減少生物膜形成和抑制貼壁生長的目的。利用這個平臺,研究人員在4個月內(nèi)成功進(jìn)化出2株耐高溫的昆蟲病原真菌突變株,廣泛應(yīng)用于害蟲防治[38]。

    隨著低成本及人性化的培養(yǎng)設(shè)備的研發(fā),一些適用于小實(shí)驗(yàn)室的連續(xù)自動化裝置漸漸發(fā)展起來,如Matteau等[39]設(shè)計(jì)的多功能連續(xù)培養(yǎng)裝置(versatile continuous culture device,VCCD)、Takahashi等[40]設(shè)計(jì)的具有開發(fā)資源的多路復(fù)用恒濁器(Flexostat)及Hoffmann等[41]設(shè)計(jì)的基于擴(kuò)展卡爾曼濾波器原理估計(jì)細(xì)胞增長率的低成本恒濁器等,這些裝置皆具有由3D打印或易于操作的部件制成、受開放資源的軟件控制的特點(diǎn)。

    此外,近幾年液體處理機(jī)器人[42]、微型恒化器陣列[43]及微液滴恒化器[44]等的出現(xiàn),推動了連續(xù)自動化裝置與高通量平行化培養(yǎng)篩選策略的結(jié)合,在微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化過程中對選擇參數(shù)、突變率及突變范圍實(shí)現(xiàn)更高程度的控制,并一定程度上限制了人為干預(yù)。最近,Wong等[45]開發(fā)了一種名為“eVOLVER”的可任意縮放及實(shí)現(xiàn)用戶自定義的裝置,其開源的濕件、軟件及硬件等高度模塊化,可實(shí)現(xiàn)快速重新配置以適應(yīng)幾乎所有的自動化連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化過程中自動化培養(yǎng)過程的高度可控性及高通量性的平衡。

    表1 微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化策略的對比

    4 總結(jié)

    實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化大大加速了人類改造蛋白質(zhì)、代謝途徑甚至細(xì)胞的步伐,在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)新功能、提高酶活性及提升微生物細(xì)胞工廠產(chǎn)能等研究中具有應(yīng)用潛力。連續(xù)進(jìn)化方法,可有效打破基因突變范圍、篩選能力及突變率等傳統(tǒng)進(jìn)化方法的遺傳瓶頸,大幅度減少人為操作,為同時(shí)進(jìn)行多個平行進(jìn)化實(shí)驗(yàn)提高可行性,也減少人為因素帶來的實(shí)驗(yàn)誤差,大大推動了微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的發(fā)展。

    體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化方法也有其自身的缺陷,如連續(xù)培養(yǎng)過程中逃逸篩選的無效突變菌株的擴(kuò)增、對自動化設(shè)備的高度依賴等,故體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化應(yīng)與其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法相互補(bǔ)充,而非簡單替代。目前計(jì)算機(jī)輔助的體外進(jìn)化設(shè)計(jì)技術(shù)的普及[46-48]、生物分子功能與報(bào)告分子或細(xì)胞生長耦聯(lián)技術(shù)的廣泛研究[49-50]及連續(xù)自動化技術(shù)的進(jìn)步等,將為充分實(shí)現(xiàn)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的潛力發(fā)揮出關(guān)鍵作用。

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