豌豆低聚肽硒螯合物的穩(wěn)定性研究

秦修遠，劉文穎，張靜波，朱少新，魯軍，谷瑞增，蔡木易*，張春樂*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京,100015)2(廣東中食營科生物科技有限公司，廣東 東莞,523122)

硒作為人體必須從外界攝入的微量元素之一，對于維持人的生命活動發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明缺硒會導致人免疫力低下[1]。上世紀60年代，人們發(fā)現(xiàn)克山病的產(chǎn)生與缺硒有關(guān)[2]。目前常用的動物補硒方法有口服亞硒酸鈉，或在飼料中添加富硒酵母等[3-5]。但研究表明，有機態(tài)的硒比無機態(tài)的硒毒性更小，并且對于機體來說有更高的吸收率[5]。

豌豆低聚肽是豌豆蛋白酶解后得到的小分子肽物質(zhì)。過去的代謝模型指出，生物機體不能夠直接吸收和利用蛋白質(zhì)大分子。只有經(jīng)過水解后得到氨基酸小分子才能在體內(nèi)發(fā)揮作用。但近年來研究表明，動物對蛋白質(zhì)的需要也依賴于一定數(shù)量的小分子活性小肽[6]。已有報道指出豌豆低聚肽具有抗菌[7]、抗氧化[8]、ACE抑制[9]等活性，是一種常見的生物活性肽。

豌豆低聚肽硒螯合物是一種將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的新型補硒制品。已有前人研制出大豆肽硒螯合物[10]、靈芝肽硒螯合物[11]、魚頭蛋白肽硒螯合物[12]。但有關(guān)豌豆低聚肽與硒螯合卻鮮有報道。本文以分子質(zhì)量分布和硒含量為指標，探究豌豆低聚肽硒螯合物對溫度、pH和消化方式的穩(wěn)定性，為最終其在保健品市場中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

豌豆低聚肽，廣東中食營科生物科技有限公司(1407WDSC001)；五水亞硒酸鈉(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；3′3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB 4HCl)(試劑級)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(生物技術(shù)級)、Biotopped Amresco；氫溴酸(分析純)，天津市福晨化學試劑廠；其他常規(guī)試劑(分析純)，北京化工廠；胃蛋白酶、胰蛋白酶，南寧龐博生物有限公司；三氟乙酸(分析純)，Alfa Aesar公司；乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher公司；透析袋(截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u)，Biotopped；超純水，實驗室自制。

1.1.2 儀器

EL20 pH計，Mettler Toledo；KQ-250E超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；1204007恒溫水浴鍋，蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司；酶標儀，Dynex Spectra Mr；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京陸希科技有限公司；萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；F30200150 凱氏定氮儀，Velp Scientifica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆低聚肽硒螯合物的制備

取5 g豌豆低聚肽溶于100 mL超純水中，制備成5%的豌豆低聚肽水溶液。加入2.5 g五水亞硒酸鈉，于超聲波振蕩器中充分混合片刻。調(diào)節(jié)pH為9.0，在恒溫水浴80 ℃條件下螯合30 min。趁熱迅速倒入約4倍體積的95%乙醇。封口后靜置過夜。將上清液倒出，于35 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘干，得到豌豆低聚肽硒螯合物樣品。

1.2.2 豌豆低聚肽硒螯合物得率和螯合率計算公式

(1)

其中：m1，螯合物中硒元素的質(zhì)量；m2，加入螯合體系硒元素的質(zhì)量。

(2)

其中：m3，螯合產(chǎn)物質(zhì)量；m4，加入螯合體系總物質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.3 豌豆低聚肽硒螯合物的分子質(zhì)量分布測定

采用高效凝膠過濾色譜法測定樣品分子質(zhì)量。選用乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量為189 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量為451 Da)、桿菌酶(分子質(zhì)量為1 450 Da)、抑肽酶(分子質(zhì)量為6 500 Da)、細胞色素C(分子質(zhì)量為12 500 Da)5種肽標準品分別配制濃度為0. 1%溶液，選用聚四氟乙烯(孔徑為0.2 μm)過濾膜，將樣品過濾后再進樣。經(jīng)高效凝膠色譜過濾后可繪制相對分子質(zhì)量校正曲線。

流動相體積比為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，進樣體積: 10 μL;流速: 0.5 mL /min;柱溫度：20 ℃，檢測波長: 220 nm。利用紫外檢測器和GPC軟件進行采集和處理數(shù)據(jù)。將樣品測得的數(shù)據(jù)代入相對分子質(zhì)量校正曲線方程中可得到樣品的肽分子質(zhì)量和分布情況。用峰面積歸一化法可計算得不同分子質(zhì)量范圍肽的相對百分比。

1.2.4 豌豆低聚肽硒螯合物指標的測定

配制1μg/mL的硒標準溶液，精確量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL硒標準溶液，以超純水加至10 mL。加10 mL混酸(V(硝酸)∶V(高氯酸)=4∶1)電加熱爐上消解至澄清淡黃色狀態(tài)。添加5 mL 1∶1鹽酸，電加熱爐上繼續(xù)消解至1 mL。后加入10 mL EDTA-2Na溶液，10 mL 10%鹽酸羥胺溶液，混合后以1∶1鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2～3。然后加入質(zhì)量濃度為0.5%的DAB溶液，遮光靜置30 min。以40%NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.8～7.0，以10 mL甲苯萃取反應產(chǎn)物。取有機層溶液，在420 nm處檢測吸光值。以硒濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制硒標準曲線。

將經(jīng)過不同的溫度、pH值和消化方式處理后的豌豆低聚肽硒螯合物分別取3 mL轉(zhuǎn)移至透析袋。經(jīng)60 h透析后，采用上述方法進行消解和檢測吸光度，對應標準曲線，確定樣品硒含量。

1.2.5 豌豆低聚肽硒螯合基礎(chǔ)物理化性質(zhì)的測定

參照國標法GB 5009.3—2010，測定豌豆低聚肽硒螯合物的水分含量。參照國標法GB 5009.5—2010 測定豌豆低聚肽硒螯合物的總氮(蛋白質(zhì))含量。參照國標法GB 22729—2008，測定豌豆低聚肽硒螯合物中酸溶蛋白的含量。

1.2.6 熱穩(wěn)定性實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取20 mL溶液置于離心管中，分別在25、40、60、80、100 ℃下恒溫水浴2 h，其中25 ℃為室溫對照組。后冷卻至室溫，檢測其分子質(zhì)量分布，經(jīng)透析60 h后檢測硒含量。

1.2.7 酸堿穩(wěn)定性實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg /mL的溶液，取20 mL溶液置于離心管中，分別用1 mol /L HCl和1 mol /L NaOH調(diào)節(jié)各管pH至3、5、7、9，11于37 ℃恒溫水浴鍋中放置2 h，同時設(shè)置一未處理的對照組，后冷卻至室溫，檢測其分子質(zhì)量分布，經(jīng)透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8 體外模擬胃腸消化道實驗

1.2.8.1 胃蛋白酶消化實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取30 mL溶液置于離心管中。以1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH=2.0，在37℃恒溫水浴中孵育20 min。后添加0.6%(物料比，質(zhì)量分數(shù))的胃蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理4 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質(zhì)量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8.2 胰蛋白酶消化實驗

將豌豆低聚肽硒螯合物樣品溶于超純水，配制成濃度為3 mg/mL的溶液，取30mL溶液置于離心管中。以10% NaOH調(diào)節(jié)溶液pH=7.5，在37 ℃恒溫水浴中孵育20 min。添加0.2%(物料比，質(zhì)量分數(shù))的胰蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質(zhì)量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.8.3 先胃蛋白酶消化實驗再胰蛋白酶消化實驗

按照1. 2. 7. 1的方法進行胃蛋白酶消化后，用10% NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育20 min，加入0.2%(物料比，質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶，充分混勻，迅速取出其中15 mL于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應，作為消化前對照。剩余部分置于37 ℃恒溫水浴中處理6 h，然后于沸水浴中處理20 min以終止酶解反應。室溫下冷卻后檢測其分子質(zhì)量分布，透析60 h后檢測硒含量。

1.2.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS v20 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，若t檢驗，P<0.05，則證明有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

豌豆低聚肽中總蛋白含量為88.30%，酸溶蛋白含量為84.20%，水分含量4.46%，灰分含量5.04%，游離氨基酸含量(以干基計)2.93%，水解氨基酸含量66.82%，肽含量(以干基計)81.27%。

2.2 豌豆低聚肽螯合硒產(chǎn)物指標和理化性質(zhì)

豌豆低聚肽硒螯合物的產(chǎn)物螯合率為(57.23±0.36)%，得率為(27.87±0.26)%，與相似工藝的肽硒螯合物[12]相比，具有更高的硒螯合率。已有大量文獻[13-14]指出，肽與某些元素螯合時，主要微量元素的離子形式與多肽中NH2+以及—COO—形成配位鍵，也存在少部分的物理附著。也有文獻[12]具體指出肽硒螯合物的螯合機制為Se4+與—NH2配合，羧基以共價鍵方式也與Se形成配合。推測豌豆低聚肽硒螯合物中，由Se4+提供4d空軌道，N、O能夠提供孤對電子，可分別占據(jù)空軌道形成配位鍵。

經(jīng)檢測，豌豆低聚肽硒螯合物的酸溶蛋白含量為(23.22±0.12)%，總氮含量為(23.87±0.30)%，酸溶蛋白占粗蛋白的97.28%。說明豌豆低聚肽硒螯合物中的蛋白分子質(zhì)量都較低。而較低分子質(zhì)量的蛋白則更利于人體吸收。

水分活度對于食品的儲藏具有參考價值。經(jīng)檢測，豌豆低聚肽硒螯合物的水分含量為(14.17±1.12)%。此水分含量相當于含水15%～17%的小麥粉，相應的aw值是0.80～0.87，文獻指出，在此范圍內(nèi)，大多數(shù)霉菌和葡萄球菌都可被抑制[15]。

經(jīng)檢測，豌豆低聚肽硒螯合物分子質(zhì)量分布如表1所示。有超過76%的分子質(zhì)量分布在1000 u以下，含量最高的是小于500 u的小肽，約占58.87%，此類小肽更易于在生物體內(nèi)發(fā)揮作用[16]。

表1 豌豆低聚肽硒螯合物分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物的熱穩(wěn)定性

豌豆低聚肽硒螯合物經(jīng)過40、60、80、100 ℃處理2 h后，觀察其水溶性、溶液顏色基本維持不變，經(jīng)檢測其分子質(zhì)量分布如表2所示。分子質(zhì)量在1 000 Da之下的部分所占比例都在93%左右波動，大于1 000 Da的分子質(zhì)量所占比例變化低于2%。整體上看，溫度的影響使得140～1 000 Da的比例增加。不同溫度處理后，豌豆低聚肽硒螯合物硒含量如圖1所示。與對照相比，豌豆低聚肽硒螯合物的硒含量無顯著性差異(a=0.05)。說明經(jīng)過不同溫度處理后，螯合物的硒含量無變化，豌豆低聚肽硒螯合物具有良好的熱穩(wěn)定性?？赡苁怯捎谕愣沟途垭闹痪哂械鞍踪|(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，對溫度的耐受能力較強[16]。

表2 不同溫度下豌豆低聚肽硒螯合物分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different temperature

圖1 不同溫度下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.1 Selenium content of selenium-chelating pea oligopeptideat different temperature (*P<0.05)

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的酸堿穩(wěn)定性

豌豆低聚肽硒螯合物在不同pH值條件下處理后，其分子質(zhì)量分布如表3所示。在中性條件下，小于140 Da分子質(zhì)量所占比例增加約10%，同列變化最大?？赡苁谴祟愋‰?尤其是分子質(zhì)量小于500 Da)耐受酸堿環(huán)境，反而在中性條件下易斷裂。分子質(zhì)量在1 000 Da之下的比例變化不大，最大變化率不超過3%。可進一步證明肽鏈耐受酸堿環(huán)境。圖2中顯示了經(jīng)過不同pH處理后硒含量的變化。在偏酸性和中性環(huán)境下，硒含量都顯著降低(a=0.05)，變化率在20%左右。在堿性環(huán)境中，硒含量變化較小。但在pH 3～11，硒含量仍在78%以上，說明豌豆低聚肽與硒螯合的產(chǎn)物對于酸堿環(huán)境仍具有很強的穩(wěn)定性。

表3 不同pH值下豌豆低聚肽硒螯合物的分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different pH

圖2 不同pH下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.2 Selenium content of selenium-chelating peaoligopeptide at different pH (*P<0.05)

2.5 豌豆低聚肽硒螯合物的體外消化穩(wěn)定性

豌豆低聚肽硒螯合物分別經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶再胰蛋白酶處理，分子質(zhì)量分布結(jié)果如表4所示。豌豆低聚肽硒螯合物經(jīng)過不同的體外消化方式處理后，分子質(zhì)量在1 000 Da之下的部分所占的比例增加，其中，經(jīng)過胃蛋白酶處理后的增加了約7%，經(jīng)胰蛋白酶處理后的增加了約9%，先胃蛋白酶處理再胰蛋白酶處理后的增加了約12%。這證明了豌豆低聚肽經(jīng)過酶的消化處理，分解成更小分子質(zhì)量的肽段。經(jīng)過酶解后，1 000 Da以下所占的比例都在90%以上，小分子肽段，特別是二肽、三肽更利于人體吸收[17。經(jīng)過不同的消化方式處理后，豌豆低聚肽硒螯合物中硒含量變化較小。結(jié)合分子質(zhì)量分布的變化表，豌豆低聚肽硒螯合物在經(jīng)過酶的消化后，雖然被水解成小肽段，但是并沒有完全破壞硒與肽的配位結(jié)構(gòu)，可以推測，豌豆低聚肽與硒的配位鍵較為穩(wěn)定，不隨肽鏈的斷裂而破壞。則硒可隨小肽段穩(wěn)定的經(jīng)過胃液和腸液，最后在腸道中通過小腸黏膜對肽的吸收[18-19]而被間接吸收。

表4 不同消化方式下豌豆低聚肽硒螯合物的分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide at different digestion mode

圖3 不同消化方式下豌豆低聚肽硒螯合物硒含量(*P<0.05)Fig.3 Selenium content of selenium-chelating pea oligopeptideat different digestion mode (*P<0.05)

3 結(jié)論

本研究以豌豆低聚肽和亞硒酸鈉為原料，制備出豌豆低聚肽硒螯合物，并對其基礎(chǔ)理化性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化方式穩(wěn)定性進行了探究。實驗結(jié)果表明，豌豆低聚肽硒螯合物水分含量為(14.17±1.12)%，水分含量較低，能夠抑制大多數(shù)霉菌和葡萄球菌。酸溶蛋白含量為(23.22±0.12)%，總氮含量為(23.87±0.30)%，酸溶蛋白占粗蛋白的97.28%。分子質(zhì)量分布在1 000 Da以下的占比超76%。小分子肽占比較大，利于人體吸收。

豌豆低聚肽硒螯合物對于熱處理具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)過不同溫度處理后，分子質(zhì)量在1 000 Da以下的部分比例變化都低于2%，硒含量變化不顯著。對于酸堿環(huán)境也具有穩(wěn)定性，經(jīng)過酸或堿處理過后，分子質(zhì)量在1 000 Da以下部分的比例變化低于3%，硒含量雖有一定變化，但仍在78%以上。對于不同消化方式也具有一定的穩(wěn)定性，經(jīng)過酶解后，分子質(zhì)量在1 000 Da以下部分的比例都在90%以上，而硒含量變化較小。硒可進入腸道，通過黏膜對肽的攝入而被間接吸收，從而達到補充硒的功效。豌豆低聚肽硒螯合物可作為一種新型的補硒制劑，開發(fā)成適用于缺硒人群的營養(yǎng)與功能食品。