Foxp2 小鼠模型中發(fā)育性言語障礙的分子遺傳學(xué)研究

李 慧

(北京師范大學(xué)珠海分校, 珠海 519080)

語言的生成和理解是人類特有的能力，是社會(huì)和文化不可分割的一部分。近二十年來，從分子角度對(duì)語言產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制進(jìn)行了全面研究。最初的工作是發(fā)現(xiàn)與言語、語言或閱讀相關(guān)的基因組變異和基因損傷。第1 例發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因是叉頭框P2 基因(forkhead box P2, FOXP2)，它編碼轉(zhuǎn)錄因子，其突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育言語和語言障礙[1]。鑒定FOXP2 與其它候選基因可在分子機(jī)制層面提供至關(guān)重要的信息，而目前的挑戰(zhàn)是確定它們編碼的蛋白質(zhì)如何影響支持人類言語的大腦回路。

神經(jīng)生物學(xué)和認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)的研究[2]發(fā)現(xiàn)，言語和語言技能取決于皮質(zhì)和亞皮質(zhì)的多套神經(jīng)回路的活性。構(gòu)成人類語言機(jī)能的組件(如記憶、聽覺意識(shí)和運(yùn)動(dòng)控制等)與其它脊椎動(dòng)物廣泛共享，且分子生物學(xué)研究[2]發(fā)現(xiàn)，言語和語言相關(guān)基因也在具有習(xí)得性發(fā)聲行為的其他物種中存在，且通常有著“深同源性”。因此，人類言語很可能部分建立于參與感覺運(yùn)動(dòng)整合和運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)的祖先腦網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)之上，對(duì)于其他物種中FOXP2等基因的直系同源物的研究顯然非常有價(jià)值。以下著重討論基因操作小鼠模型中的相關(guān)研究及發(fā)現(xiàn)。

1 FOXP2 基因簡介

FOXP2是研究英國一個(gè)多世代家族(KE家族)所獲知的第1 例參與言語和語言的基因[3]，該家族中約半數(shù)(15人)持有FOXP2雜合突變, 導(dǎo)致1個(gè)氨基酸被替代，從而影響了所編碼蛋白質(zhì)調(diào)控靶基因的能力[4]。除了包含F(xiàn)OXP2 基因在內(nèi)的大范圍染色體缺失外，與語言能力有關(guān)的多種FOXP2突變(如錯(cuò)義突變、無義突變和轉(zhuǎn)位斷點(diǎn))也在各種人群中被證實(shí)過[5]。與FOXP2 基因損傷有關(guān)的一個(gè)共同特征是： 不能精確和穩(wěn)定地控制流暢言語所需的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和運(yùn)動(dòng)順序，被稱為發(fā)育性言語運(yùn)動(dòng)障礙(developmental verbal dyspraxia，DVD)或兒童言語失用(childhood apraxia of speech, CAS)。患病人群所犯的言語錯(cuò)誤每句話之間各不相同，隨著話語復(fù)雜度的增加錯(cuò)誤更加嚴(yán)重。除了DVD/CAS外, 其它表達(dá)性和感受性的損傷也存在,影響口頭和書面語言[5]。當(dāng)基因組破壞主要影響FOXP2 時(shí), 認(rèn)知的非言語部分相對(duì)不受影響[5]。對(duì)KE 家族的神經(jīng)影像學(xué)研究表明，在尾狀核、額下回(包括Broca區(qū))和小腦腹側(cè)有微小而嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常。功能磁共振成像(MRI)顯示在語言任務(wù)中，KE 家族成員的皮質(zhì)內(nèi)核、Broca 區(qū)和羅蘭迪克島蓋激活不足。這些區(qū)域與FOXP2 的高表達(dá)位點(diǎn)(包括皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、下橄欖體和小腦)一致[3]。以上研究顯示FOXP2 影響參與言語和運(yùn)動(dòng)控制的腦區(qū)，言語相關(guān)的神經(jīng)回路與其它運(yùn)動(dòng)過程相關(guān)的神經(jīng)回路廣泛重疊。

在所編碼蛋白的序列及神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)模式上，小鼠Foxp2 與人FOXP2 高度相似，始于胚胎期的表達(dá)一直持續(xù)到成年期[6]。目前已獲得Foxp2 基因受破壞的幾種小鼠系列，包括導(dǎo)致Foxp2蛋白缺失的突變體以及重現(xiàn)了在KE家族中發(fā)現(xiàn)的無義突變的小鼠系列[2]。完全缺乏Foxp2或只有非功能蛋白的純合子小鼠發(fā)育遲緩或有嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)損傷，在3～4 周齡時(shí)死亡。相反，雜合子小鼠存活到成年期且看起來明顯正常[7]。具有KE家族雜合無義突變的小鼠在超聲音節(jié)的聲學(xué)結(jié)構(gòu)上沒有變化，但所產(chǎn)生的序列更短，且在社交環(huán)境中不能向更復(fù)雜的句法轉(zhuǎn)換，從而推斷，盡管小鼠的超聲發(fā)聲是內(nèi)源性的，但Foxp2 對(duì)發(fā)聲序列的作用在小鼠與人類中是保守的[8]。

2 分子網(wǎng)絡(luò)

對(duì)妊娠中期的胎鼠腦進(jìn)行大規(guī)模的染色質(zhì)免疫沉淀和表達(dá)譜分析[9], 發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)育期間Foxp2所調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò), 為所影響的生物過程提供了線索。此工作鑒定出的靶基因, 突顯了它們?cè)谡{(diào)控神經(jīng)細(xì)胞突起生長和突觸可塑性的潛在作用。如今, 研究的注意力轉(zhuǎn)向Foxp2 本身如何受到調(diào)控。例如一項(xiàng)研究[10]報(bào)道, miRNAs(miR-9和miR-32)抑制Foxp2 表達(dá)，影響神經(jīng)細(xì)胞突起生長和皮質(zhì)投射神經(jīng)元的輻射性遷移。受Foxp2 調(diào)控的基因——接觸蛋白關(guān)聯(lián)蛋白樣蛋白2(CNTNAP2), 與包含語言缺陷在內(nèi)的神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān), 甚至與普通人群之間的語言發(fā)育變化相關(guān)[11]。其他Foxp2 的靶點(diǎn)和相互作用組也參與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥、躁郁癥、癲癇和智力殘疾。含sushi 重復(fù)蛋白X 連鎖2 基因(SRPX2)是其中一個(gè)靶基因, 它的突變將導(dǎo)致腦中言語相關(guān)區(qū)域的癲癇和DVD/CAS。SRPX2 抑制會(huì)損傷突觸發(fā)生, 導(dǎo)致出生7日齡(P7)仔小鼠超聲發(fā)聲減少[12]。SPRX2 基因敲除初生小鼠表現(xiàn)超聲發(fā)聲個(gè)體異常和社交興趣減少,表明SPRX2 在聲音發(fā)育和社交回路中的作用[13]。在小鼠紋狀體中，F(xiàn)oxp2 與突觸抑制基因肌細(xì)胞增強(qiáng)子2C(Mef2c)負(fù)向互動(dòng)。Mef2c 抑制皮質(zhì)紋狀體突觸形成和樹突棘形成，但本身又受到Foxp2 的抑制。Foxp2 缺失去抑制Mef2c, 紋狀體內(nèi)及整體性Mef2c 減少則可挽救由Foxp2 缺失突變帶來的發(fā)聲和紋狀體樹突棘的缺陷。因此Foxp2-Mef2C信號(hào)通路對(duì)皮質(zhì)-紋狀體回路的形成非常關(guān)鍵，人體中這一信號(hào)通路的缺陷可能促成一系列的神經(jīng)精神障礙[14]。腦皮層中Foxp2 純合突變導(dǎo)致淀粉樣βA4 前體蛋白結(jié)合家族A 成員2(Apba2)表達(dá)下調(diào), 該基因參與小鼠的趨向行為以及人類的自閉癥譜系障礙[15]。這些數(shù)據(jù)共同暗示了跨越診斷界線的共同的分子和神經(jīng)回路機(jī)制。然而仍不清楚靶點(diǎn)的調(diào)控具有細(xì)胞類型特異性還是腦區(qū)域特異性, 且尚不明確靶點(diǎn)的異常調(diào)控對(duì)整個(gè)生物體有什么影響。

3 Foxp2 基因與感覺處理

Foxp2 在參與感覺處理和整合的皮質(zhì)和亞皮質(zhì)區(qū)中表達(dá)。嗅覺系統(tǒng)中, 其表達(dá)發(fā)生在嗅球小球?qū)印⒏綄傩崆蚝托峤Y(jié)節(jié)。Foxp2 也在丘腦軀體感受區(qū)及上行的聽覺和視覺中繼核團(tuán)中表達(dá)。皮質(zhì)區(qū)內(nèi), Foxp2 在VI 層表達(dá)廣泛, 在V層的表達(dá)則主要局限于聯(lián)合區(qū)和運(yùn)動(dòng)前區(qū)[6]。迄今為止所做工作主要集中于聽覺系統(tǒng)。小鼠中Foxp2 在丘腦內(nèi)側(cè)膝體核的表達(dá)與聽覺體驗(yàn)相關(guān)。Kurt 等[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp2-R552H雜合子(與KE家族突變相同)比起對(duì)照組來說有更長潛伏期和更小振幅的聽覺腦干反應(yīng)(ABRs)，ABRs 能反映激活神經(jīng)元數(shù)量或同步性的變化。然而Foxp2-S321X 雜合子(有一半劑量的功能FOXP2蛋白質(zhì))的ABRs與野生型幼仔沒有顯著差異。Foxp2-R552H 和Foxp2-S321X 雜合子都顯示出更慢的聽覺-運(yùn)動(dòng)聯(lián)合的學(xué)習(xí)過程(由穿梭箱條件性回避實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)估), 然而盡管Foxp2-S321X 小鼠有正常的ABRs，它們的聽覺運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)卻存在更嚴(yán)重的缺陷[17]。

4 Foxp2 基因與運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)

Foxp2表達(dá)于與運(yùn)動(dòng)技能相關(guān)的皮質(zhì)-紋狀體和皮質(zhì)-小腦回路。其中，小腦內(nèi)的表達(dá)局限于浦肯野細(xì)胞和深小腦核，并在延髓的下橄欖核中強(qiáng)烈表達(dá)[6]。紋狀體內(nèi)Foxp2 的表達(dá)富集于紋狀小體中[14]。且在含多巴胺受體1(DRD1)的中型多棘神經(jīng)元(MSNs)中表達(dá)水平更高[18]。Foxp2 也存在于黑質(zhì)致密部、腹側(cè)被蓋區(qū)和丘腦下核，可能在動(dòng)機(jī)與運(yùn)動(dòng)輸出的整合中發(fā)揮作用[6]。如上所述，F(xiàn)oxp2 純合子突變體顯示了更加嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙和出生后致死率，而雜合子可存活，看起來大體正常。然而，對(duì)有正常運(yùn)動(dòng)能力的Foxp2-R552H 雜合子的分析[19]發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诩铀俚霓D(zhuǎn)棒和自動(dòng)轉(zhuǎn)輪系統(tǒng)上存在學(xué)習(xí)缺陷。這些對(duì)運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)和表現(xiàn)的影響比起人類FOXP2基因損傷的結(jié)果更為廣泛，這些不同的發(fā)現(xiàn)可能反映了FOXP2功能的物種差異。在人類和小鼠中開發(fā)新的行為任務(wù)或者細(xì)致分析現(xiàn)有任務(wù)將有助于確定哪些運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)特征正在受影響，例如速度、精確度或變化性。

對(duì)皮質(zhì)-紋狀體回路的針對(duì)性研究[20]表明，F(xiàn)oxp2-KO雜合子中的紋狀體多巴胺水平增加而樹突長度減小, Foxp2-R552H 雜合子中皮質(zhì)-紋狀體突觸的長時(shí)程抑制(LTD)受損[19]。對(duì)在加速旋轉(zhuǎn)輪上訓(xùn)練的Foxp2-R552H 雜合小鼠的體內(nèi)電生理記錄發(fā)現(xiàn)異常高的紋狀體活性[21]。Foxp2 雜合突變體在表達(dá)DRD1的MSNs中增加了GABA受體介導(dǎo)的抑制型電流, 從而增加了紋狀體直接通路的抑制[22]。與上述研究結(jié)果相反, Enard 等[20]發(fā)現(xiàn)該基因被部分人源化的Foxp2-Hum純合子有升高的皮質(zhì)-紋狀體LTD，在運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)中沒有檢測(cè)到差異。這些鼠在皮質(zhì)、紋狀體和丘腦中(不在小腦中)有更長的樹突, 因此推測(cè)發(fā)生在人類世系中的FOXP2 中的氨基酸變化特異地影響皮質(zhì)-紋狀體回路。盡管Foxp2-Hum 純合子和雜合子突變小鼠都有正常的生育能力和生命期限, 但它們的紋狀體和相關(guān)的皮質(zhì)基底核回路中存在顯著的神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)解剖學(xué)變化, 這些回路是運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知行為所必需的[23]。Schreiweis 等[24]在Foxp2-Hum 純合突變成年小鼠中分析紋狀體三個(gè)亞區(qū)(腹側(cè)紋狀體、背外側(cè)紋狀體和背內(nèi)側(cè)紋狀體)以及各亞區(qū)紋狀小體和Matrix間區(qū)的Foxp2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Foxp2 人源化突變會(huì)以區(qū)域和間區(qū)特異的方式顯著影響Foxp2high(Foxp2 呈高表達(dá)水平)的神經(jīng)元的分布。背側(cè)紋狀體中僅在紋狀小體間區(qū)內(nèi)Foxp2high神經(jīng)元的密度增加了2 倍，而在腹側(cè)紋狀體中的Matrix 區(qū)間才出現(xiàn)了Foxp2high神經(jīng)元密度增加的現(xiàn)象。由于紋狀體不同亞區(qū)參與腦學(xué)習(xí)活動(dòng)的不同階段，紋狀小體和Matrix 區(qū)間也在發(fā)育、連接性和功能方面有所不同，因此作者推測(cè)這樣一種區(qū)域-間區(qū)特異的改變一定會(huì)有特定的行為效應(yīng)，如實(shí)驗(yàn)室中顯示的Foxp2 人源化會(huì)損傷小鼠紋狀體依賴的嗎啡行為敏感化。

Foxp2-Hum純合突變成年小鼠的超聲發(fā)聲的結(jié)構(gòu)和使用不受影響[25]，這與之前許多研究顯示的“小鼠超聲發(fā)聲幾乎不受發(fā)聲學(xué)習(xí)的影響”的結(jié)論一致。

在小腦中，F(xiàn)oxp2-R552H 雜合鼠在平行纖維浦肯野細(xì)胞突觸中顯示了微妙的電生理變化[19]。Usui 等[26]通過體外免疫共沉淀和體內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)初生小鼠小腦中Foxp2的類泛素化修飾調(diào)控浦肯野細(xì)胞的發(fā)育、運(yùn)動(dòng)功能和發(fā)聲交流。然而在此領(lǐng)域開展了相對(duì)較少的工作。如今通過使用條件性基因敲除等策略使Foxp2區(qū)域特異性缺失變得可能, 對(duì)解釋該基因在不同回路中的作用以及正確解釋Foxp2 缺失后的紋狀體和小腦異常很重要。

Castellucci等[27]追蹤幼年到成年Foxp2雜合突變小鼠發(fā)現(xiàn), 其求偶歌曲中有嚴(yán)重的異常, 包括發(fā)聲減少、音節(jié)序列更短和節(jié)奏不規(guī)則, 說明Foxp2在幼年和成年小鼠的發(fā)聲運(yùn)動(dòng)控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。幼年斑胸草雀的紋狀體X 區(qū)中，miR-9 過度表達(dá)所伴隨的FoxP2 表達(dá)下調(diào), 會(huì)導(dǎo)致音節(jié)省略、歌曲模仿不精確等鳴唱損傷[28]。Adam 等[29]通過使用慢病毒載體在斑胸草雀X 區(qū)下調(diào)FoxP2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥相關(guān)基因CNTNAP2 表達(dá)也隨之減少。此外由于年齡或鳴唱原因?qū)е碌腇oxP2 下調(diào)也會(huì)導(dǎo)致CNTNAP2 表達(dá)的下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)也證明, FoxP2 激活CNTNAP2 啟動(dòng)子。鳴禽中的研究證明, CNTNAP2 是FoxP2 的直接目標(biāo)基因, 可能會(huì)影響與鳴曲學(xué)習(xí)和維持相關(guān)的突觸功能。

5 展望

對(duì)人類、小鼠、鳴禽和其它物種中FOXP2直系同源物的研究將極大地促進(jìn)對(duì)其神經(jīng)功能的理解。神經(jīng)細(xì)胞突起生長和突觸可塑性是FOXP2靶點(diǎn)所深度參與的兩個(gè)過程。這些研究結(jié)果已在活體內(nèi)確認(rèn)FOXP2缺失導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)和感覺運(yùn)動(dòng)整合的缺陷以及異常的紋狀體可塑性。小鼠模型是高度有效的基因操作系統(tǒng), 可從分子、細(xì)胞、形態(tài)學(xué)、發(fā)育、電生理和行為等多方面研究人類病因。基因操作可能局限于特定的腦區(qū)、細(xì)胞類型或發(fā)育時(shí)間點(diǎn), 而今后對(duì)行為微結(jié)構(gòu)更詳細(xì)的研究配以更復(fù)雜的分析方法將有助于解釋微妙表型的紛繁復(fù)雜。小鼠研究的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于所能利用的遺傳、分子和電生理工具的范圍更廣。目前有對(duì)動(dòng)物遺傳上確定的神經(jīng)回路的神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行成像和記錄的技術(shù)，而且可在這些回路中利用光電子技術(shù)操作其活性。把這些技術(shù)利用于Foxp2基因損傷小鼠將充分利用該物種作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì), 闡明該基因?qū)θ祟愌哉Z和語言的貢獻(xiàn)。

除了研究基因功能障礙帶來的語言影響，小鼠也可用來評(píng)估人類進(jìn)化中潛在的表型效應(yīng)。語言和直立行走等人類的基本特征, 與顱面成型與骨骼重塑等一系列解剖結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。然而人類進(jìn)化中這些形態(tài)特征如何出現(xiàn)尚不明晰。Xu 等[30]通過分析骨骼特異的Foxp2 基因敲除小鼠，鑒定了Foxp2 在顱面成型與骨骼重塑中的作用，發(fā)現(xiàn)Foxp2 有助于調(diào)控后肢的力量與長度，維持關(guān)節(jié)軟骨和椎間盤，這些都是適應(yīng)于直立運(yùn)動(dòng)的解剖特征。考慮到Foxp2 在運(yùn)動(dòng)技能和言語相關(guān)腦回路中的作用，可推測(cè)該基因也促進(jìn)言語和直立運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)的協(xié)同進(jìn)化。

考慮到人類語言的復(fù)雜性以及言語和語言障礙的多樣性，單種動(dòng)物模型無法全面揭示其神經(jīng)機(jī)制，需在呈現(xiàn)復(fù)雜聲音行為的鳴禽和其他物種中引入更先進(jìn)的遺傳研究手段，例如在非人類靈長物中研究聲音回路是一個(gè)迅速發(fā)展的領(lǐng)域。日本為期十年的腦研究計(jì)劃(Brain/MINDS)專注于對(duì)狨猴的研究。Takahashi 等[31]通過對(duì)狨猴的研究發(fā)現(xiàn)，正常的聲音發(fā)育可能受到父母反饋的影響。通過對(duì)遺傳性言語障礙個(gè)體的基因掃描，已發(fā)現(xiàn)一系列與言語/社交/認(rèn)知相關(guān)的基因(如： FOXP2,CNTNAP2, FOXP1, GNPTAB, GNPTG, NAGPA)，且在動(dòng)物模型中得到研究。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，例如高通量基因分型和下一代全基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，將進(jìn)一步闡明語言相關(guān)疾病(如言語失用、特殊語言障礙、發(fā)育型讀寫障礙)的遺傳基礎(chǔ)。