近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

續(xù)國強(qiáng), 高繼萍, 劉茂林, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點(diǎn)實驗室, 太原030001)

中國倉鼠(Cricetulus griseus)，俗稱中國地鼠,已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。它的雙側(cè)頰囊薄，易于翻出且血管豐富，在腫瘤移植、各種口腔疾病研究及微循環(huán)研究中優(yōu)勢突出[1]。中國倉鼠基礎(chǔ)研究薄弱、標(biāo)準(zhǔn)化資料相對較少，至今尚未有適用于中國倉鼠的遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重阻礙了近交系中國倉鼠的推廣和應(yīng)用。本研究以國內(nèi)外大量相關(guān)文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，哺乳類實驗動物遺傳質(zhì)量控制GB14923-2010[2]為參照，群體遺傳學(xué)理論為依據(jù)，制定了中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立不僅使近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量有據(jù)可依，為將來建立中國倉鼠遺傳信息庫奠定了基礎(chǔ)； 而且使我國實驗動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)一步完善和發(fā)展，為將來制定動物源性生物藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒； 可在很大程度上保證科研數(shù)據(jù)的可靠性、一致性和可重復(fù)性，對提升我國實驗動物科學(xué)自主創(chuàng)新的研究水平，進(jìn)而提高我國在實驗動物領(lǐng)域的國際地位也具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 建系與繁殖

山西醫(yī)科大學(xué)薄家璐教授分別于1980 年和1981 年從北京郊區(qū)購回兩批野生中國倉鼠，經(jīng)模擬自然環(huán)境及籠養(yǎng)兩個階段后成功培育出四個家系； 由于近交衰退，保種至今的只有A 家系和E家系[3](山醫(yī)群體)。經(jīng)權(quán)威部門檢測認(rèn)證, 該群體已達(dá)到近交系標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2 命名

參照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)委員會批準(zhǔn)的實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)GB14923-2010并根據(jù)群體遺傳學(xué)理論制定。

1.3 建立檢測方法

近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測采用微衛(wèi)星標(biāo)記法。

1.3.1 微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建 利用中國倉鼠尾組織提取基因組DNA，隨后將其超聲打碎，選擇長度在500～1 000 bp的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平。將形成平末端的基因組DNA沉淀濃縮并利用QIAquick 試劑盒回收后, 用電泳法檢測其回收濃度。把回收的DNA 與接頭以1∶100 的比例混合于10 μL 反應(yīng)體系, 14 ℃連接, 70 ℃滅活。然后將連接好的DNA 與DNA 的解鏈溫度(Tm)值相近的探針雜交后, 通過鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行富集。將富集的微衛(wèi)星DNA片段插入到pGEM-T載體上后轉(zhuǎn)入DH10B大腸桿菌，構(gòu)建中國倉鼠微衛(wèi)星DNA 富集文庫，取陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3.2 微衛(wèi)星引物的設(shè)計與篩選 應(yīng)用軟件Tandem Repeats Finder 查找重復(fù)序列，軟件Vec Screen 去除載體序列，軟件Consed 及Phrep 等進(jìn)行拼接，利用軟件Primer 3.0 設(shè)計引物135 對。從這135 對引物中挑選易產(chǎn)生多態(tài)性的目標(biāo)引物訂購合成。使用目標(biāo)引物對中國倉鼠DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性進(jìn)行篩選。對多態(tài)性良好引物的正向鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記。用標(biāo)記的引物對組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行STR 掃描，然后對其基因型進(jìn)行判讀。從微衛(wèi)星富集基因組DNA文庫中, 分離鑒定了17個新的微衛(wèi)星位點(diǎn)并對其進(jìn)行了分析。

2 近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.1 定義

通過全同胞兄妹交配或親子交配培育，且最少持續(xù)20代，全部個體均有一對共同祖先來自于第20 代或其以后代數(shù)的品系稱為近交系[5]。

2.2 命名

近交系中國倉鼠嚴(yán)格按照小鼠標(biāo)準(zhǔn)化遺傳命名國際委員會制定的命名法及中華人民共和國GB14923-2010 標(biāo)準(zhǔn)命名。

2.3 繁殖

近交系中國倉鼠繁殖方法的選用原則是, 在不發(fā)生遺傳污染和保持其同基因性的條件下, 利用近親繁殖盡可能提高品系的純合度，使其近交系數(shù)無限接近100%。無論是引進(jìn)還是自己培育，一般均采用單線法、平行線法及優(yōu)選法中的一種。

引種： 作為繁殖原種的近交系中國倉鼠不僅要符合我國實驗動物管理相關(guān)規(guī)定，還應(yīng)有完善的品系名稱、生物學(xué)特性、育種單位和遺傳背景等資料且來源清楚[6]。

交配： 在群體中挑選3月齡個體進(jìn)行全同胞交配。每日均對倉鼠種群進(jìn)行發(fā)情周期檢測，挑選發(fā)情期母鼠合籠交配。近交系中國倉鼠供應(yīng)群及擴(kuò)大群中任意個體均在核心群中有5 代以內(nèi)的共同祖先，核心群還可根據(jù)相應(yīng)的選育目的，根據(jù)其生物學(xué)、遺傳學(xué)等特性挑選與配種，且盡可能選用綜合優(yōu)選法進(jìn)行配種。

交配后管理： 中國倉鼠獨(dú)居生存、性情殘暴，繁殖過程中往往發(fā)生撕咬造成雄鼠損失，所以要對其交配進(jìn)行實時監(jiān)測，交配動作一經(jīng)完成，即檢查雌鼠陰道栓，及時分籠飼育。

2.4 遺傳質(zhì)量監(jiān)控

2.4.1 遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 近交系中國倉鼠必須符合下列要求： ①除具有個體性、同基因性、基因純合性、遺傳穩(wěn)定性、分布的廣泛性及背景資料可查性等特性外，所引種或培育的近交系中國倉鼠還需完全符合近交系定義的規(guī)定； ②近交系的生存環(huán)境安全舒適，繁殖方法科學(xué)合理，生產(chǎn)保種記錄卡保存完整、清晰可查； ③經(jīng)微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳質(zhì)量檢測法檢測，質(zhì)量合格。

2.4.2 檢測方法及具體實施 ①檢測方法： 近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測選用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測法。具體方法按附錄1 進(jìn)行； ②取樣： 采用隨機(jī)取樣的方法，隨機(jī)從各飼養(yǎng)籠盒中選取成年倉鼠； ③結(jié)果的判定： 可用Gene Marker V 1.6 對STR 的掃描結(jié)果進(jìn)行判讀，近交系中國倉鼠基因型為純合子，無雜峰且峰型均勻； ④檢測間隔： 任意時間、任何動物都可能發(fā)生自發(fā)突變，因而近交系動物遺傳質(zhì)量檢測的時間間隔一般不宜超過2 年。

3 討論

3.1 制定標(biāo)準(zhǔn)的迫切性和意義

中國倉鼠原產(chǎn)于我國黃河以北地區(qū)，全身被毛。它具有染色體大、易于辨認(rèn)且數(shù)量較少的特點(diǎn)，在細(xì)胞遺傳、輻射遺傳、分子生物等領(lǐng)域的應(yīng)用尤為廣泛[7]。中國倉鼠山醫(yī)群體近交系由于近親交配而患有與人類Ⅱ型糖尿病類似的自發(fā)遺傳性糖尿病，群體發(fā)病率在20% 左右，是研究糖尿病預(yù)防、治療及預(yù)后理想的人類疾病動物模型； 其雄鼠睪丸下垂且碩大，適于微生物寄生，是理想的病原體接種器官； 除心電圖波形與人類大體一致外，它血液中血紅蛋白、紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血清蛋白等含量也與人類相近，更是各類醫(yī)學(xué)實驗極佳的實驗動物模型。國外于1940年代末將中國倉鼠引入實驗室進(jìn)行研究與繁殖[4]。我國張昌穎、李宏廣等學(xué)者曾先后對其進(jìn)行了培育和馴化, 但由于未突破其近親衰退等限制未能延續(xù)。直至1980 年代初期，山西醫(yī)科大學(xué)薄家璐教授等從北京購回兩批野生中國倉鼠, 并對其進(jìn)行馴養(yǎng)和繁殖； 經(jīng)過模擬自然環(huán)境和籠養(yǎng)兩個階段, 成功將其培育成符合國際標(biāo)準(zhǔn)的近交系實驗動物。一直以來, 學(xué)者們主要集中于對中國倉鼠繁殖、保種、生物學(xué)特征、遺傳標(biāo)記、染色體核型等方面的研究。其分子進(jìn)化、標(biāo)準(zhǔn)化特別是遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究尚屬空白[8], 目前尚沒有關(guān)于中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的國家或地方標(biāo)準(zhǔn)。因此, 提供可靠的中國倉鼠遺傳背景數(shù)據(jù),建立中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)就顯得極為迫切。建立近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 規(guī)范中國倉鼠的繁殖、保種及應(yīng)用, 將進(jìn)一步完善我國實驗動物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系, 為建立更加完善和全面的實驗動物遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

3.2 選擇微衛(wèi)星標(biāo)記檢測法的優(yōu)勢

微衛(wèi)星序列是指存在于真核生物基因組中，以1～6個核苷酸為單位，經(jīng)多次串聯(lián)重復(fù)形成的簡單重復(fù)序列，其長度約為100 bp，是研究分子進(jìn)化、構(gòu)建遺傳圖譜、診斷遺傳疾病常用的分子標(biāo)記。選用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測中國倉鼠的遺傳質(zhì)量具有諸多優(yōu)勢，如在真核生物基因組中大約每隔10～50 kb 就存在一個微衛(wèi)星, 它不僅存在于非編碼區(qū)還存在于外顯子染色體上的任意區(qū)域； 微衛(wèi)星標(biāo)記通常不具表型效應(yīng)，故對動物個體不造成傷害且無次級效應(yīng)。微衛(wèi)星標(biāo)記為共顯性遺傳，能夠?qū)游锘蚣兒献雍碗s合子進(jìn)行很好地區(qū)分。此外，微衛(wèi)星位點(diǎn)一般采用先擴(kuò)增，再測序分離的檢測方法?？赏瑫r對多個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行檢測且檢測耗時短，一般一次檢測可在1 d 內(nèi)完成[9]。

3.3 關(guān)于近交系中國倉鼠遺傳質(zhì)量檢測方法及結(jié)果分析

該標(biāo)準(zhǔn)提出了使用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量。目前, 可用于實驗動物遺傳質(zhì)量檢測的方法有生化標(biāo)記法、形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法等。基于微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量龐大、多態(tài)性豐富, 檢測方法快速簡便，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，被國內(nèi)外專家學(xué)者一致認(rèn)為是動物遺傳質(zhì)量檢測的最佳分子標(biāo)記，因此該標(biāo)準(zhǔn)決定選用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)來檢測中國倉鼠的遺傳質(zhì)量。構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫及設(shè)計篩選微衛(wèi)星引物時[10], 利用超聲打碎、凝膠電泳回收、SNX 接頭連接、PCR 擴(kuò)增、鏈親和素耦聯(lián)磁珠親和捕捉、感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化等成功構(gòu)建了中國倉鼠微衛(wèi)星DNA 富集文庫。通過查找重復(fù)序列、去除載體序列、拼接目的序列、引物設(shè)計、引物挑選、PCR 擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測、聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選等步驟成功篩選出適合于中國倉鼠微衛(wèi)星DNA的特異性引物。最終, 從中國倉鼠微衛(wèi)星富集DNA文庫中,分離鑒定了17個新的近交系中國倉鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)并對其進(jìn)行了分析。

理論上，采樣數(shù)越多，群體遺傳質(zhì)量檢測結(jié)果就越準(zhǔn)確可靠[11]。但過多采樣，不僅浪費(fèi)了人力物力、增加了檢測成本，還缺乏一定的可操作性。故本標(biāo)準(zhǔn)從實際出發(fā)，制定了每個群體至少抽樣30只個體進(jìn)行檢測的標(biāo)準(zhǔn)。近交系數(shù)是評價近交系群體的關(guān)鍵指標(biāo)，近交系數(shù)越接近100%近交系質(zhì)量越好；且近交系個體的基因型應(yīng)均為純合子，所有被測樣品檢測位點(diǎn)的等位基因都應(yīng)符合品系特征，沒有新的等位基因出現(xiàn)為合格的近交系中國倉鼠，否則判為不合格。

附錄1 (規(guī)范性附錄) ：

近交系中國倉鼠的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法

1 基因組DNA 的提取

用苯酚氯仿法或相應(yīng)的試劑盒提取近交系中國倉鼠的基因組DNA。檢測A260/A280值在1.8 左右的基因組DNA 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2 微衛(wèi)星位點(diǎn)

從附表1中隨機(jī)挑選10個微衛(wèi)星位點(diǎn)，對近交系中國倉鼠的遺傳質(zhì)量進(jìn)行檢測。

3 PCR 擴(kuò)增

3.1 PCR擴(kuò)增體系 PCR反應(yīng)的總體積為10 μL：10 ng/mL 模板： 0.8 μL； 1pmol/L 上、下游引物： 各0.1 μL； 5 U/μL Taq DNA 聚合酶： 0.1 μL； 2.5 mmol/L dNTPs 0.7 μL； 25 mmol/L Mg2+： 0.8 μL； 10×Buffer 1.0 μL； dd H2O 6.4 μL。

3.2 PCR 擴(kuò)增程序 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s； 退火(具體溫度見附表1)30 s； 72 ℃延伸45 s； 30 個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。

3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后, 取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2% 瓊脂糖凝膠中, 電泳檢測產(chǎn)物。

3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物掃描 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，微衛(wèi)星引物標(biāo)記的熒光種類是正向鏈的5’端藍(lán)色熒關(guān)標(biāo)記(FAM), 內(nèi)參是GeneScanTM-500 LIZTM。取3～5 μL PCR 產(chǎn)物于384 孔板中，加入8 μL 含有內(nèi)標(biāo)的Loading Buffer(去離子甲酰銨)，上機(jī)STR 掃描。

4 掃描結(jié)果及判定

一般合格的擴(kuò)增產(chǎn)物，STR 掃描后經(jīng)Gene Marker V1.6判讀的結(jié)果有兩種： 一種為只有一條主波的純合子基因型； 另一種為含兩條主波的雜合子基因型。所有樣品檢測位點(diǎn)的等位基因都符合品系的特征，沒有新的等位基因出現(xiàn)為合格的近交系中國倉鼠； 否則判為不合格。

附表1 中國倉鼠部分微衛(wèi)星位點(diǎn)信息及引物擴(kuò)增條件

5 結(jié)果報告

根據(jù)判定結(jié)果，對被測近交系中國倉鼠群體做出檢測報告。