微生物酯酶的開發(fā)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

畢文慧，桂倫，姚健*

1(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250100)2(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌，330200)

酯酶(estersae)是一種能夠催化酯鍵斷裂和形成，參與轉(zhuǎn)酯、酯化和酯交換反應(yīng)的水解酶。廣義上講，羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)、芳基酯酶(arylesterase，EC3.1.1.2)、脂肪酶(triacylglycerol lipase，EC 3.1.1.3)、丹寧酸酶(tannase，EC3.1.1.20)等統(tǒng)稱為酯酶[1-2]。酯酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，其中大部分工業(yè)酯酶都來源于微生物，如細(xì)菌的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.)、低溫桿菌屬(Psychrobactersp.)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)；真菌的根霉菌屬(Rhizopussp.)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)、曲霉菌屬(Aspergillussp.)；酵母的假絲酵母(Candidasp.)、畢赤酵母(Pichiasp.)、紅酵母(Rhodotorulasp.)和釀酒酵母(Saccharomycopissp.)均為工業(yè)生產(chǎn)中重要的產(chǎn)酯酶微生物[3-4]。微生物酯酶作為生物催化劑具有來源廣、種類多、效率高、反應(yīng)條件溫和、不需添加輔酶和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，因此在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。

1 微生物酯酶的研究進(jìn)展

1.1 新型酯酶的開發(fā)

根據(jù)酯酶最適反應(yīng)溫度可分為高溫酯酶、中溫酯酶和低溫酯酶。中溫酯酶(Mesophilic esterase)是目前開發(fā)和應(yīng)用最多的一類酯酶，其在常溫下具有較高催化效率，但在高溫、低溫環(huán)境下易失活。由于中溫酯酶對熱、冷、有機(jī)溶劑和高鹽環(huán)境抗性較差，限制了其在一些存在極端溫度、化學(xué)試劑條件下的工業(yè)生產(chǎn)中使用。

高溫酯酶(Thermophilic esterase)在高熱環(huán)境中有著特殊的穩(wěn)定性和催化能力，海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)TM1160酯酶在90 ℃下作用1 h后仍可保留50%酶活性[5]，而嗜熱泉生古細(xì)菌K1(AeropyrumpernixK1)酯酶則可將作用時(shí)間延長到160 h[6]。此外，許多高溫酯酶對有機(jī)溶劑、重金屬、鹽等化學(xué)試劑有較高的耐受性。如TM1160 酯酶可在甲醇、DMSO等有機(jī)試劑中常溫處理12 h后仍保持活性[5]；分離自紅海宏基因組文庫的EstATII酯酶可在4.5 mol/L鹽溶液中保持活性，在鈣、鎂、鐵等金屬離子存在時(shí)至少可以保持60%酶活性[7]。大多數(shù)酯酶底物特異性較低，可催化不同結(jié)構(gòu)酯類的水解，但來源于海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的高溫酯酶TM0077卻具有極高的底物特異性，這一發(fā)現(xiàn)有利于提高酯解反應(yīng)的專一性、降低副產(chǎn)物[8]。高溫酯酶的上述特性有利于降低對生產(chǎn)中冷卻系統(tǒng)的需求，減少雜菌污染，提高產(chǎn)物純度，非常適用于食品熱加工行業(yè)。

低溫酯酶(Psychrophilic esterase)在低溫或常溫條件下均具有較高催化效率，但在高溫條件下會(huì)快速失活。研究人員從海洋、冰川和沼澤等低溫環(huán)境中分離到了一些性能優(yōu)良的低溫酯酶。這些低溫酯酶最適溫度一般在40 ℃左右，并能在較長時(shí)間低溫處理后保留較高酶活性。如海旋菌(Thalassospirasp.)GB04J01.的酯酶ThaEst2349最適作用溫度為45 ℃，且在10 ℃和20 ℃下孵化2 h后仍具有85%和90%的酶活性[9]；腸桿菌(Enterobactersp.)酯酶EstA最適作用溫度為40 ℃，在0 ℃下可保留75%的酶活性[4]；冰川鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasglacialis)PAMC 26605的羧酸酯酶EstSP2最適作用溫度為40 ℃，在4～25 ℃活性保持穩(wěn)定，并且在濃度為40%的二甲基亞砜、甲醇、乙醇溶液中仍可保留75%酶活性[10]。此外一些具有特殊抗性的極端低溫酯酶也不斷被發(fā)現(xiàn)，來源于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的酯酶lp_3505最適作用溫度為5 ℃，在20 ℃下保存20 h后仍保留60%酶活性，并可耐受20%的高濃度鹽溶液[11]。低溫酯酶可用于低溫加工環(huán)境，有利于防止產(chǎn)物分解和熱變性；反應(yīng)活化能較低，可以節(jié)約能源，在熱敏性食品生產(chǎn)中極具應(yīng)用潛力。

1.2 宏組學(xué)技術(shù)在酯酶開發(fā)中的應(yīng)用

新型酯酶的不斷發(fā)現(xiàn)與酯酶開發(fā)技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)。傳統(tǒng)開發(fā)采用分離培養(yǎng)技術(shù)，但近年來利用傳統(tǒng)技術(shù)獲得新活性物質(zhì)越來越困難，宏基因組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)則為酯酶的開發(fā)提供了新思路。宏基因組學(xué)(Metagenome)是指以特定環(huán)境中提取的全部微生物基因組DNA為研究對象，不需要對微生物進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，通過構(gòu)建宏基因組文庫并運(yùn)用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的活性物質(zhì)[12]。目前通過構(gòu)建土壤、海洋沉積物、活性淤泥、堆肥、溫泉等宏基因組文庫，已成功篩選到許多新型酯酶。GU等[13]提取了栗樹林土壤的總DNA，總DNA經(jīng)純化后與pWEB-TNC載體連接并轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliEPI100-T1R中，構(gòu)建了土壤宏基因組文庫。之后利用含三丁酸甘油酯的LB平板從文庫中篩選到新型酯酶EstGX1和EstGX2，兩者為微生物脂類水解酶第IV家族的新成員，對兩種酯酶進(jìn)行特性研究發(fā)現(xiàn)EstGX2具有較高熱穩(wěn)定性，在99 ℃下處理55 min后仍能保持40%活性，并且具有獨(dú)特的嗜堿性，最適pH為9.0。同樣利用宏基因組技術(shù)，LEE等[14]構(gòu)建了豬糞-蘑菇廢棄物堆肥宏基因組文庫并分離到新型酯酶est7K，對該酶酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)條件為40 ℃和pH 10.0，并且在30%甲醇存在時(shí)其活性可提高2.1倍；RANJAN等[15]在海洋沉積物宏基因組文庫和溫泉宏基因組文庫中共挖掘到10種酯酶基因，這些功能基因在序列結(jié)構(gòu)、催化功能上有其獨(dú)特之處，并且部分酯酶基因來源于未知微生物。宏基因組學(xué)從大量不可培養(yǎng)微生物中發(fā)現(xiàn)了許多催化特性、耐受性獨(dú)特的新型酯酶，極大地豐富了酯酶種類。

除了發(fā)現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中有潛在用途的酯酶以外，宏基因組文庫功能篩選研究還發(fā)現(xiàn)了一些新的酶學(xué)特性信息，在牛瘤胃細(xì)菌宏基因組文庫中識別到一種新型酯酶Est5S，其與任何已知脂肪水解酶均沒有顯著的序列相似性，被歸類為酯酶新家族——第XV家族[16]；在一個(gè)曬鹽場土壤宏基因組文庫中篩選到的一種屬于第IV家族(HSL)的新型酯酶EstSP，但該酶具有獨(dú)特的GDSGG保守區(qū)域，這有別于之前在HSL酯酶家族中所發(fā)現(xiàn)的GDSAG和GTSAG保守區(qū)域[17]。

宏基因組學(xué)研究針對全部基因組序列，但是在基因組中存在大量非編碼序列，這些序列的存在干擾了功能序列的研究，使宏基因組學(xué)僅適用于基因組較小的原核生物中。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Metatranscriptomics)是在宏基因組學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，其以特定環(huán)境、特定時(shí)期所有生物轉(zhuǎn)錄的全部RNA為研究對象。該技術(shù)可以直接通過微生物mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，避免了真核微生物基因組中內(nèi)含子的影響，將基因篩選范圍從原核微生物擴(kuò)展到了真核微生物[18]。KELLNER等[19]提取、純化了森林土壤的總RNA，并以其為模板合成cDNA，經(jīng)SfiI酶切后的cDNA片段與pTEF-MF酵母表達(dá)載體相連接，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建了宏轉(zhuǎn)錄組文庫；并利用Saccharomycescerevisiae磷酸酶突變體從文庫中篩選到了新型酸性磷酸酯酶。TAKASAKI等[20]采用類似方法構(gòu)建了森林土壤宏轉(zhuǎn)錄組文庫，通過序列和功能篩選相結(jié)合的方法從中獲得129個(gè)糖水解酶類序列，并且這些序列大多來源于真核微生物。隨著RNA提取、純化技術(shù)的不斷進(jìn)步，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在新酶開發(fā)中的應(yīng)用也將越加深入。

2 酯酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究

2.1 酯酶在食品加工中的應(yīng)用

2.1.1 乳制品加工中的應(yīng)用

酯酶在乳制品增香、脫脂或奶味香精加工方面極具應(yīng)用潛力，在加工中使用可改善產(chǎn)品的口感、風(fēng)味和品質(zhì)。酸熱脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的高溫酯酶EST2能高效合成短鏈脂肪酸，將其用于干酪加工可合成風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯，而未添加EST2酯酶的對照組中則未檢測到該成分[21]；脂肪酶同樣可以通過水解牛奶中的短鏈脂肪丁酸和己酸生成芳香成分，提高牛奶感官品質(zhì)[22]。此外，乳制品經(jīng)酯酶水解處理后可制得富含中、短碳鏈脂肪酸，奶油香氣自然、柔和，風(fēng)味接近于奶酪的天然奶味香精。Novozyme Palatase 20000L、Lipozyme-435、Novozyme-435等脂肪酶通過水解牛奶或稀奶油，均可制得奶香濃郁、純正的酶解產(chǎn)物[23-24]。

但以單一酯酶催化制備奶味香精，其產(chǎn)物成分分布較窄、風(fēng)味單調(diào)、易存在不良后味，難以獲得高品質(zhì)的產(chǎn)品。為進(jìn)一步提高奶味香精品質(zhì)，研究人員嘗試將多種酯酶復(fù)合用于奶味香精制備。以Palatase 20000L和Lipase MER組成的復(fù)合酶體系酶解處理黃油制得的酶解產(chǎn)物含有中、短鏈脂肪酸、酮類、酯類等11種成分，具有純正的奶油香氣，且口感更加飽滿、風(fēng)味濃郁、無不良后味[25]；先以脂肪酶A12和脂肪酶MER復(fù)合處理黃油，再加入蛋白酶酶解后制得天然奶酪味香基，具有典型奶酪香氣，并且味道厚重、柔和，留香時(shí)間更長[26]。

上述商業(yè)化酯酶作用溫度一般在45～80 ℃之間，較高的溫度易導(dǎo)致乳制品水解產(chǎn)生的熱敏性香味成分在加工過程中揮發(fā)或氧化變性，影響產(chǎn)品風(fēng)味。解決上述問題最直接的方法就是降低生產(chǎn)溫度，因此研究人員嘗試將低溫酯酶用于乳品加工。以酯酶restTB11在25 ℃下酶解處理稀奶油，所得酶解產(chǎn)物相較Palatase 20 000L產(chǎn)物，風(fēng)味化合物種類更豐富，相對含量更高，酸味較少，奶香更加濃郁[3]，由此證明低溫酯酶是乳制品加工行業(yè)的潛力工業(yè)酶。

2.1.2 油脂加工中的應(yīng)用

油脂是食物的重要組成成分，油脂中脂肪酸主鏈的長度、飽和度、支鏈數(shù)及脂肪酸的位置決定著油脂的營養(yǎng)價(jià)值、感官價(jià)值、商品價(jià)值。酯酶可通過改變脂肪酸鏈中甘油醛的位置，實(shí)現(xiàn)油脂的增值加工。代可可脂作為可可脂替代品工業(yè)需求量大，具有較高商品價(jià)值。其可通過一種或多種低價(jià)油脂經(jīng)酯交換反應(yīng)制得，如以價(jià)格低廉的棕櫚油中間分提物為原料，經(jīng)LipozymeTM酶催化可制備代可可脂[27]；而以棕櫚油中間分提物與菜籽油混合物為原料，經(jīng)Lipozyme RM IM脂肪酶催化制備的代可可脂中富含omega-3和omega-6，特性與可可脂相近[28]。

以酯酶處理肉制品可以催化肉類中脂肪水解，實(shí)現(xiàn)肉制品降脂、脫脂，從而降低心血管疾病、糖尿病的致病風(fēng)險(xiǎn)。來源于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的脂肪酶可在72 h內(nèi)將雞肉脂肪降解為短鏈醛類或酮類物質(zhì)，從而降低肉制品中脂肪含量[29]。酯酶處理肉制品還可以提高產(chǎn)品感官品質(zhì)，以1.50%用量Yiming脂肪酶在50 ℃、pH 8下水解處理濃度為55%的豬油2.5 h，1.25%用量Novozymes脂肪酶在55 ℃、pH 8下水解處理濃度為55%的豬油4.0 h，1.00%用量Amano脂肪酶在pH 6、45 ℃下水解處理濃度為50%的豬油2.5 h，所得水解產(chǎn)物中游離脂肪酸含量較對照組分別高出89.40%、85.80%和89.92%。油酸、反油酸、十七碳烯酸等多種脂肪酸為豬肉揮發(fā)性芳香物質(zhì)的前體，大量脂肪酸的產(chǎn)生有助于增加豬肉的特征性香味及促進(jìn)香氣的釋放[30]。

酯酶在油脂工業(yè)中的另一重要用途是水解油脂制備游離脂肪酸，如米根霉(Rhizopusoryzae)中的rProROL脂肪酶可水解大豆油獲得甘油二酯[31]。但單一酶水解油脂效率普遍低于復(fù)合酶，Novozym 435、Lipozyme TL-IM和Lipozyme RM-IM等單一商品酶對大豆油水解率均低于50%，但將80% Lipozyme RM-IM與20% Novozym 435配合使用水解率可達(dá) 80%以上[32]；對來源于黑曲霉的4種脂肪酶的活性研究也同樣證實(shí)復(fù)合酶對大豆油的水解率更高[33]。

2.1.3 酒類生產(chǎn)中的應(yīng)用

酯類物質(zhì)是酒中的主要芳香組分，其產(chǎn)生與酯酶的釋放有關(guān)，酯酶能促進(jìn)酯類合成，調(diào)控酯類和游離酸之間的平衡，影響酒的特征香氣。傳統(tǒng)生產(chǎn)中酯類物質(zhì)合成反應(yīng)過程非常緩慢，需要長期窖藏才能完成。為快速提升酒中酯類物質(zhì)含量，生產(chǎn)廠家常以富含酯類物質(zhì)的酯化液勾兌酒液或在發(fā)酵過程中添加酯酶制劑或產(chǎn)酯酶微生物[34]。

濃香型白酒可以利用酯化液進(jìn)行勾兌來提高酒體中總酯含量，增加酒香和風(fēng)味。酯化液是通過酯化反應(yīng)將有機(jī)酸、醇等成分轉(zhuǎn)化為類似白酒香味成分的混合液。以己酸和乙醇混合液為原料，添加脂肪酶僅經(jīng)過7 d的反應(yīng)即可獲得富含己酸乙酯的酯化液，大大縮短了酯類物質(zhì)合成時(shí)間[35]。更加經(jīng)濟(jì)的方式是以產(chǎn)酯酶紅曲霉處理白酒釀造中的副產(chǎn)物生產(chǎn)酯化液。釀酒尾水是白酒液態(tài)發(fā)酵主要副產(chǎn)物，將其與乙醇、己酸混合，經(jīng)紅曲霉發(fā)酵可制得總酯含量137.01 mg/100 mL，其中己酸乙酯含量222.71 mg/L，乳酸乙酯含量74.61 mg/L的酯化液[36]。黃水是白酒固態(tài)發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，以其為原料添加紅曲發(fā)酵，在最佳條件下總酯的含量為0.63 g/100 mL，其中己酸乙酯和乳酸乙酯的相對百分含量最高可達(dá)42.70%[37]。以上述酯化液進(jìn)行濃香型白酒的勾兌，可達(dá)到提高酒質(zhì)和生產(chǎn)效率的雙重目的。

酒類生產(chǎn)中所用酶制劑主要包括脂肪酶、磷酸酯酶、酯合成酶、酯分解酶等。傳統(tǒng)生產(chǎn)中的酯酶均由釀造微生物分泌產(chǎn)生，在葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵時(shí)期，釀酒酵母及乳酸菌所產(chǎn)酯化酶能夠提高或降低酒中各種酯類物質(zhì)的含量，對酒香的形成具有重要意義[38]。在現(xiàn)代生產(chǎn)中可通過添加酯化酶制劑或分離純化產(chǎn)酯化酶微生物來提高其含量。紅曲霉酯化酶制劑可提升濃香型白酒中己酸乙酯含量，提高己酸乙酯與乳酸乙酯比例[39]；來源于酒類酒球菌(Oenococcusoeni)的酯酶EstA7可將葡萄酒中乙酸己酯的含量提高22.7%[38]。篩選自青酒大曲的紫色紅曲霉FBKL3.0018具有較強(qiáng)酯化能力，以其生產(chǎn)的高酯化大曲用于濃香型白酒的生產(chǎn)可減少用曲量，加快酒醅酯化速度，提高成酒中總酸、總酯含量，出酒率及優(yōu)質(zhì)品率分別提高了0.7%和10.8%[40]。一株從海泥中篩選到的產(chǎn)酯酶枯草芽孢桿菌，將其粗酶制劑用于無窖泥釀造濃香型白酒，成酒中己酸乙酯可達(dá)2 236.13 mg/L[41]。

2.2 酯酶在食品農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用

除了在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用，酯酶還可用于食品安全監(jiān)測。在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中通常會(huì)施用農(nóng)藥，大多數(shù)農(nóng)藥難以完全降解會(huì)直接或間接地殘留于農(nóng)產(chǎn)品中，通過生物鏈的富集最終進(jìn)入人體，對人體健康造成損害。其中有機(jī)磷農(nóng)藥作為使用最廣泛、毒性最強(qiáng)的農(nóng)藥，極大影響了食用農(nóng)產(chǎn)品的安全性[42]。目前，氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、超臨界流體色譜法(SFC)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等都可對農(nóng)藥殘留進(jìn)行高靈敏度和高精確度的檢測，但由于所用儀器設(shè)備昂貴、耗時(shí)較長和專業(yè)性強(qiáng)等因素難以實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品原位實(shí)時(shí)快速檢測。

近年來，生物傳感器快速檢測技術(shù)因易操作、成本低、能快速原位檢測而被廣泛研究及應(yīng)用于食品(農(nóng)產(chǎn)品)農(nóng)殘檢測中。目前發(fā)展最為成熟的生物傳感器是以乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)構(gòu)建的電流型生物傳感器。AChE能催化底物乙酰膽堿水解產(chǎn)生膽堿和乙酸等具有電活性的物質(zhì)，而有機(jī)磷農(nóng)藥可以抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，降低電活性的物質(zhì)量，使電流檢測信號減弱。利用這一反應(yīng)，可以建立酶活性抑制率與有機(jī)磷農(nóng)藥的線性關(guān)系，從而定量檢測食品中農(nóng)殘含量[43]。目前所構(gòu)建的乙酰膽堿酯酶生物傳感器已在多種食品農(nóng)殘檢測中成功應(yīng)用，以Pt/ZnO/AChE為電極的生物傳感器檢測到蘋果中克菌丹殘留量，檢測范圍在0.05～25.0 μmol/L，檢測限為107 nmol/L，重復(fù)率可達(dá)98.4%～102.4%[44]；改進(jìn)后的Pt/ZnO/AChE/殼聚糖生物傳感器檢測到了大米中丁硫克百威殘留量，并將檢測靈敏度降低到納米級別，檢測范圍在5～30 nmol/L，檢測限為 0.24 nmol/L，重復(fù)率為99.06%～100.96%[45]。利用構(gòu)建的玻璃碳/石墨烯/AChE生物傳感器對西紅柿樣品中的胺甲萘殘留進(jìn)行定量檢測，檢測值為(0.47±0.04)μmol/L[46]，AChE生物傳感器對農(nóng)藥殘留普遍具有較高的檢測靈敏度。以上生物傳感器是基于對AChE的抑制作用而實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藥殘留量的檢測，但AChE蛋白質(zhì)的低穩(wěn)定性及對金屬、有機(jī)溶劑的敏感性導(dǎo)致其使用受到限制。為提高生物感應(yīng)器穩(wěn)定性，JANIS等[47]以具有高穩(wěn)定性可適應(yīng)不同pH值和溫度、對低濃度有機(jī)溶劑和洗滌劑具有耐受性的羧酸酯酶EST2構(gòu)建生物傳感器，并將其用于果汁、酒及水中農(nóng)殘的定性、定量檢測，質(zhì)譜檢測證實(shí)該生物傳感器檢測結(jié)果可靠。

3 展望

對酯酶的研究一直是生物催化領(lǐng)域的重點(diǎn)，新型酯酶或酯酶家族不斷地被發(fā)現(xiàn)，但是目前真正投入工業(yè)化應(yīng)用的酯酶種類較少，且以中溫性酯酶為主。許多具有獨(dú)特催化特性，溫度、有機(jī)溶劑、高鹽環(huán)境耐受性的高溫和低溫酯酶由于產(chǎn)量低、成本高、酶學(xué)特性不能完全滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，未成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。從自然環(huán)境中挖掘適用于工業(yè)生產(chǎn)的新型酯酶，豐富酯酶資源及酶學(xué)信息，擴(kuò)展其在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用仍是將來的研究重點(diǎn)。