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    生乳中硝酸鹽還原菌的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析

    2019-02-15 07:19:46王慧敏王利粘靖祺
    中國奶牛 2019年1期
    關鍵詞:生乳稀釋液硝酸鹽

    王慧敏,王利,粘靖祺

    (黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司,哈爾濱 150078)

    硝酸鹽、亞硝酸鹽作為食品護色劑、防腐劑被廣泛應用于腌臘、醬鹵、肉灌腸、發(fā)酵肉制品等食品中,以增強和改善肉制品的色澤,延長保存時間。硝酸鹽在一定條件下可被還原為亞硝酸鹽,但鑒于過量的亞硝酸鹽對人體有一定危害,所以國家對硝酸鹽、亞硝酸鹽使用量和亞硝酸鹽的殘留量都做出了嚴格的限制。硝酸鹽、亞硝酸鹽雖可以作為食品添加劑,但在乳制品中是嚴禁使用的。牛乳中的亞硝酸鹽來源就成為控制的關鍵。我國國家標準對乳粉中的亞硝酸鹽含量做了限量規(guī)定,其含量(以NaNO2計)不得大于2mg/kg[1]。乳制品中亞硝酸鹽的來源有多方面因素,一是自然界廣泛存在這種化合物,因此,哺乳動物的乳汁分泌和形成過程中就已含有此類物質(zhì);如有研究報道,對6只大鼠舌表面細菌進行計數(shù)、分離、純化,從中發(fā)現(xiàn)4個屬的具有硝酸鹽還原性的優(yōu)勢菌[2]。二是硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化。自然界中確實存在一些微生物具有將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的能力。董競等[3]從侗族酸肉中篩選出9株具有硝酸鹽還原能力的菌株,其中2株硝酸鹽還原能力較高;何燕飛等[4]從浙江省特色腌魚制品中也分離出兩株硝酸鹽還原菌菌株。乳制品中含有豐富的含氮有機物,其在微生物的作用下可逐漸分解成氨,氨可進一步被微生物轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和亞硝酸鹽,硝酸鹽在一定條件下亦可還原為亞硝酸鹽。因此,如能有效控制生乳中的相關微生物,對亞硝酸鹽的控制可以起到輔助性作用。

    本試驗以生乳中的微生物為研究對象,對生乳中的硝酸鹽還原菌進行了分離、純化,進而進行分子生物學鑒定,以期為控制乳制品生產(chǎn)中由硝酸鹽還原菌引起的質(zhì)量風險提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與培養(yǎng)基

    生乳樣品:混合生乳樣品。

    PCA培養(yǎng)基[5]:胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,瓊脂15.0g,將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)值pH至7.0±0.2,分裝于適宜的容器中,121℃高壓滅菌15min。

    磷酸鹽緩沖液:磷酸二氫鉀(KH2PO4)34.0g,蒸餾水500mL,pH7.2;貯存液:將34.0gKH2PO4溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值,用蒸餾水稀釋至1 000mL后貯存于冰箱;稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1 000mL,分裝于適宜的容器中,121℃高壓滅菌15min。

    MPC瓊脂培養(yǎng)基[6]:胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,無抗脫脂奶粉1.0g,將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中,用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.1。加入瓊脂10~15g,煮沸使瓊脂融化。必要時使用兩層紗布(夾脫脂棉)過濾,分裝于適宜的容器中,121℃高壓滅菌15min。

    DTA培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0g,葡萄糖5.0g,2%溴甲酚紫乙醇溶液2mL,將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中,用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9±0.1。加入瓊脂10~15g,煮沸使瓊脂融化。分裝于適宜的容器中,121℃高壓滅菌15min。

    硝酸鹽還原培養(yǎng)基[7]:蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,KNO30.1~0.2g,pH7.4,分裝于試管中,121℃高壓滅菌15min。

    1.2 方法

    1.2.1 生乳中微生物的分離

    以無菌吸管吸取25mL混合生乳樣品至盛有225mL磷酸緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成10-1的樣品勻液。用1mL無菌微量移液器吸取10-1樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL磷酸緩沖液的無菌試管中,振搖試管,制成10-2的樣品勻液,以此方法配制10-1~10-6的稀釋液,每遞增稀釋一次,換用一次無菌微量移液器吸頭。各取1mL均勻涂布于PCA平板中,平行涂布3板;同時,分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照,36±1℃培養(yǎng)48±2h。

    嗜冷菌分離:取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中,平行涂布3板;同時,分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照,于6.5±0.5℃培養(yǎng)10d,培養(yǎng)皿堆疊不超過6個。

    需氧芽孢菌分離:將混合生乳樣品經(jīng)80℃加熱處理10min,按上述方法制成10-1~10-6的稀釋液,取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中,平行涂布3板;同時,分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照,36±1℃培養(yǎng)48±2h。

    嗜熱芽孢菌分離:將混合生乳樣品經(jīng)100℃加熱處理30min,按上述方法制成10-1至10-6的稀釋液。取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于DTA平板中,平行涂布3板;同時,分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照,55±1℃培養(yǎng)48±2h。

    待長出明顯菌落后,從最高稀釋倍數(shù)的平板中挑取單個菌落,以平板劃線的方式多次純化,鏡檢,初篩分離出菌落形態(tài)不同的純化菌株。

    1.2.2 硝酸鹽還原菌的篩選

    將分離純化的菌株接種于裝有硝酸鹽還原培養(yǎng)基的試管中,每個菌株接種2支并編號,保留2支空白試管作為對照,37±1℃培養(yǎng)48±2h。觀察結果時,在試管中加入幾滴Griess試劑,若出現(xiàn)紅色,則說明具備硝酸鹽還原性;如未變紅,在對應編號的另一支試管中加入鋅粉,搖動,37℃培養(yǎng)30min,加入Griess試劑,出現(xiàn)紅色,證明培養(yǎng)基中的硝酸鹽仍然存在,如不出現(xiàn)紅色,則說明硝酸鹽已被進一步還原。以此方法篩選出具備硝酸鹽還原能力的菌株。

    1.2.3 硝酸鹽還原菌的分子生物學鑒定

    變性:從培養(yǎng)基中挑取菌體于50μL TaKaRa(寶生物)微生物直接裂解 PCR緩沖液中,變性后離心取上清液作為模板,反應條件80℃,15min。使用TaKaRa(寶生物) 16S rDNA 細菌鑒定 PCR 試劑盒擴增目的片段。取變性反應液1μL,PCR預混液25μL,上、下游引物各0.5μL(20pmol/μL),定容至50μL。反應條件:94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,循環(huán)30次;72℃終延伸5min。

    使用TaKaRa (寶生物)MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒切膠回收目的片段進行DNA測序,然后在GenBank中比對。

    2 結果與分析

    2.1 硝酸鹽還原性測試

    通過硝酸鹽還原試驗,分離出具備硝酸鹽還原能力的菌株5株,如圖1所示,編號為BA-1、BA-2、BA-3、BA-4和BA-5。

    圖1 硝酸鹽還原顯色反應

    2.2 分子生物學鑒定

    將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的PCR產(chǎn)物,各取5μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2所示。

    圖2 3%瓊脂糖凝膠電泳圖

    將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的16S rDNA測序結果和GenBank已發(fā)布的菌株進行同源性比較,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    系統(tǒng)發(fā)育樹(系統(tǒng)進化樹)是研究生物進化和系統(tǒng)分類中常用的一種樹狀分枝的圖形,樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗證中該樹枝可信度的百分比,用來概括表示各種(類)生物之間的親緣關系。構建系統(tǒng)發(fā)育樹需要做Bootstrap檢驗,一般Bootstrap值大于70,認為構建的進化樹較為可靠。當Bootstrap值過低時,所構建的進化樹其拓撲結構可能存在問題,進化樹不可靠。

    通過對鑒定結果進行分析,結果如圖3所示:

    圖3 相關菌株序列的16S rDNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[原始樹(original tree),結點處數(shù)值為bootstrap值,括號外為序列登錄號]

    采用Mega3.1軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,由系統(tǒng)進化樹(圖3)和序列同源性比對(表1)可知,在系統(tǒng)進化樹上,BA-1、BA-3、BA-4與蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌聚在一起;BA -2與波茨坦短芽孢桿菌聚在一起;BA -5與luciferensis芽孢桿菌聚在一起。

    表1 序列同源性比對表

    一般認為,16S rDNA序列同源性>99%,可以認為屬于同一個種;16S rDNA序列同源性<97%,可以認為屬于不同的種;16S rDNA序列同源性小于93%,可以認為屬于不同的屬。

    3 結論

    由以上結果可以看出:生乳中存在可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的微生物,BA-1、BA-3、BA-4為蠟樣芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌;BA-2為波茨坦短芽孢桿菌;BA-5為芽孢菌屬細菌。

    從健康的奶牛乳房中剛擠下的牛乳中微生物數(shù)量極少,但由于擠乳的操作過程、器具、空間環(huán)境、貯存條件等因素都能增加生乳中的微生物種類和數(shù)量,且生乳中含有豐富的營養(yǎng),在適宜的溫度條件下,微生物可快速繁殖。生乳中微生物的種類和數(shù)量可以通過加強乳牛場和乳品加工廠的日常衛(wèi)生管理,實行有效的冷卻處理和預殺菌工藝等措施加以控制和降低。降低生乳中的微生物數(shù)量,對生乳品質(zhì)的提升至關重要。此外,鑒于微生物的分離、篩選具有隨機性,生乳中可能還存在其他具備硝酸鹽還原能力的微生物,對此還有待研究。

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