河源地區(qū)無償獻(xiàn)血人群乙型肝炎病毒感染標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果分析

劉麗華 聶湘輝 程麗娜 黃仕云 劉 靜

廣東省河源市中心血站，廣東河源 517000

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是危害 人們健康的嚴(yán)重問題之一，在國家法定傳染病報(bào)告系統(tǒng)中，乙肝報(bào)告病例居乙類傳染病的首位[1]。輸血是HBV傳播的主要途徑之一，在采供血機(jī)構(gòu)現(xiàn)行檢測(cè)的傳染病項(xiàng)目中，HBV經(jīng)輸血傳播風(fēng)險(xiǎn)最高[2]。為減低輸血傳播病毒風(fēng)險(xiǎn)，2016年1月起我站響應(yīng)國家號(hào)召改變血液樣本檢測(cè)策略：在兩遍酶免檢測(cè)的基礎(chǔ)上增加HBV、HCV及HIV核酸檢測(cè)。為了解開展核酸檢測(cè)后河源地區(qū)獻(xiàn)血人群HBV感染情況，本研究對(duì)2016 ～ 2018年無償獻(xiàn)血者樣本HBV感染標(biāo)志物檢測(cè)情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用整群抽樣方法選取2016年1月1日～2018年12月31日在本站參加無償獻(xiàn)血的無償獻(xiàn)血者60 351例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）體檢合格；（2）乙肝表面抗原膠體金試紙條快速檢測(cè)合格；（3）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）羅氏干式試紙條初篩合格；（4）血紅蛋白初篩合格。采集無償獻(xiàn)血者全血兩管，分別用于HBsAg ELISA（5mL）和HBV DNA（8mL，帶分離膠）檢測(cè)，均用EDTA-K2抗凝。

1.2 主要試劑和設(shè)備

HBsAg ELISA檢測(cè)采用法國伯樂及珠海麗珠公司試劑；抗-HCV ELISA檢測(cè)采用北京萬泰及珠海麗珠公司試劑；HIV-Ag/Ab ELISA檢測(cè)采用法國伯樂及珠海麗珠公司試劑；抗-TP ELISA檢測(cè)采用北京萬泰及珠海麗珠公司。ALT的檢測(cè)采用邁瑞公司試劑。ELISA檢測(cè)主要儀器為Xantus44/OH-150全自動(dòng)加樣儀、BEPIII全自動(dòng)酶免分析儀、UranusAE 268全自動(dòng)酶免儀等。HBV DNA檢測(cè)采用上海浩源公司的ChiTas BSS1200全自動(dòng)血液核酸檢測(cè)儀及配套試劑。HBV病毒載量測(cè)定采用美國羅氏公司High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit進(jìn)行提取。采用大連寶生物公司的Premix Ex Taq（Perfect Real Time）試劑盒和美國Agilent公司的MX3005P實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x測(cè)定HBV病毒載量。血源篩查試劑均為國家檢定權(quán)威機(jī)構(gòu)批檢合格。

1.3 方法

1.3.1 獻(xiàn)血前初篩 所有無償獻(xiàn)血者經(jīng)HBsAg膠體金試紙與ALT初篩，初篩合格后進(jìn)行血液采集。所有無償獻(xiàn)血者都簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)。

1.3.2 血清學(xué)檢測(cè) 采用兩個(gè)不同生產(chǎn)廠家的試劑對(duì)所有研究對(duì)象樣本進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、HIV-Ag/Ab、抗-TP檢測(cè)。如雙試劑或任一試劑陽性，判為不合格；雙試劑均陰性，判為合格。ALT速率法檢測(cè)結(jié)果＞50U/L判為不合格。

1.3.3 病毒核酸檢測(cè)（NAT） HBV DNA檢測(cè)排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）HBsAg、抗-HCV、HIV-Ag/Ab、抗-TP ELISA檢測(cè)不合格；（2）ALT速率法檢測(cè)不合格。對(duì)ELISA及ALT檢測(cè)結(jié)果合格的樣本57 594例，采用上海浩源公司的ChiTas BSS1200全自動(dòng)血液核酸檢測(cè)儀以8混樣模式提取血漿樣本病毒核酸，進(jìn)行熒光PCR HBV/HCV/HIV分項(xiàng)檢測(cè)，對(duì)混樣檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行單人份拆分檢測(cè)，拆分陽性判為不合格。

1.3.4 病毒載量的測(cè)定 對(duì)HBV DNA檢測(cè)不合格樣本128例進(jìn)行HBV病毒載量測(cè)定。引物序列：HBV-1為5'-CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA C-3'、HBV-2為5'-ATA TGA TAA AAC GCC GCA GAC AC-3'，雙標(biāo)探針BS-1為5'-（Cy5）TCC TCC AAT TTG TCCTGG TTA TCG CT-（BHQ2）-3（引物探針由上海英駿生物技術(shù)公司廣州分公司合成）；反應(yīng)體系為2×Premix Ex Taq 12.5μL，Rox DyeⅡ（50×）0.4μL，引物HBV-1（10μmol/L）終濃度為0.4μmol/L，引物HBV-2（10μmol/L）終濃度為0.4μmol/L，探 針BS-1（5μmol/L）終 濃 度 為0.2μmol/L，補(bǔ)蒸餾水至25μL；反應(yīng)條件為95℃ 10min，95℃ 30s、56℃ 1min，42個(gè)循環(huán)；HBV國際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSCcode：97/750，5×105IU per vial）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg及HBsAg-/HBV DNA+總體檢出率

河源地區(qū)60 351例無償獻(xiàn)血樣本中檢出HBsAg 667例，檢出率為1.11%；57 594例ELISA及ALT檢測(cè)結(jié)果陰性的樣本中檢出 HBsAg-/HBV DNA+128例，檢出率為0.22%。

2.2 不同年份、年齡及獻(xiàn)血次數(shù)的獻(xiàn)血者HBsAg及HBV DNA檢出率

2016～2018 年不同年份間HBsAg、HBsAg-/HBV DNA+檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.846，P=0.145；χ2=8.402，P=0.150）。不 同 年 齡、不 同獻(xiàn)血次數(shù)間HBsAg檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=51.513，P=0.000；χ2=492.800，P=0.000）。不同年齡、不同獻(xiàn)血次數(shù)間HBsAg-/HBV DNA+檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.217，P=0.000；χ2=15.617，P=0.000）。見表1。

表1 不同年份、年齡及獻(xiàn)血次數(shù)的獻(xiàn)血者樣本HBsAg及HBV DNA檢出情況

2.3 QPCR病毒定量結(jié)果

128例HBsAg-/HBV DNA+樣本，其中95例病毒載量范圍為0.210～1383.929IU/mL，中位數(shù)26.786 IU/mL，其余33例均不可定量，見表2。

表2 HBsAg-/HBV DNA+樣本QPCR定量結(jié)果

3 討論

采供血機(jī)構(gòu)血液檢測(cè)項(xiàng)目“乙型肝炎病毒（HBV）感染標(biāo)志物”指的是乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）。我國屬于HBV感染中等流行區(qū)[3]，但廣東省仍然是乙肝高度流行區(qū)，廣東省2014～2015年涉及169 211人的乙肝病毒社區(qū)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)廣東省的HBsAg陽性率為8.76%，其中在23～59歲的成人群體中HBsAg陽性率高達(dá)12.71%[4]。2016 ～ 2018年我站HBsAg每年檢出率分別為1.23%、1.02%、1.08%，三年間檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。河源地區(qū)HBsAg檢出率低于廣東潮汕（2.34%）[5]、四川綿陽（1.44%）[6]，高于深圳（0.63%）[7]及江蘇南京（0.34%）[8]，提示HBsAg在不同地區(qū)的差異明顯，經(jīng)過獻(xiàn)血前初篩，獻(xiàn)血人員陽性率顯著低于正常人群，但河源地區(qū)高于如深圳、南京等一線城市。自開展核酸檢測(cè)以來，共檢測(cè)57 594份樣本，檢出128例HBsAg-/HBV DNA+樣本，檢出率為0.22%，高于韶關(guān)（0.10%，1：949）[9]及深圳地區(qū)（0.056%）[10]核酸檢出率。HBV總檢出率為1.32%（795/60 351）顯著高于未開展核酸檢測(cè)前三年的檢出率1.17%（P＜0.05）。說明ELISA聯(lián)合NAT檢測(cè)有效降低了輸血傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)。河源地區(qū)HBsAg及HBV DNA陽性率均偏高，推測(cè)一方面是人群感染基數(shù)偏高，另一方面可能與該地區(qū)獻(xiàn)血人群結(jié)構(gòu)相關(guān)。從獻(xiàn)血人群結(jié)構(gòu)分析，HBsAg及HBV DNA的檢出率隨著年齡的增加逐漸增高，其中18～25歲獻(xiàn)血者檢出率最低，與葉賢林等[11]研究結(jié)論相符。我國1992年把乙肝疫苗納入免疫規(guī)劃，18～25歲年齡段人群均接受了乙肝疫苗注射，推測(cè)乙肝疫苗的接種可明顯降低獻(xiàn)血人群HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，本研究中重復(fù)獻(xiàn)血者HBsAg檢出率明顯低于初次獻(xiàn)血者。建議該地區(qū)從固定獻(xiàn)血者，特別是經(jīng)乙肝疫苗免疫的低年齡段人群采集血液，可有效降低輸血傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)。

本研究33例HBsAg-/HBV DNA+樣本不可定量，占總定量樣本數(shù)的26%（33/128）；95例病毒可定量的HBsAg-/HBV DNA+樣本中，病毒載量5～50 IU/mL占57%（54/95），1100～1400 IU/mL占5%（5/95）。提示HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者主要為低水平HBV感染，與周怡等[12-14]研究結(jié)果相符。本課題組后期將進(jìn)一步對(duì)以上獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤隨訪，補(bǔ)充乙肝兩對(duì)半及巢式PCR數(shù)據(jù)，對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)并明確具體感染類型。我站核酸系統(tǒng)單樣本檢測(cè)HBV DNA靈敏度為6.3IU/mL，8樣本混合檢測(cè)靈敏度為50IU/mL，而目前研究數(shù)據(jù)顯示隱匿性感染導(dǎo)致的HBV輸血傳播的最低感染劑量為3IU/mL[15]，遠(yuǎn)低于我站核酸檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度，因此應(yīng)選用更靈敏的核酸檢測(cè)系統(tǒng)以進(jìn)一步降低HBV經(jīng)輸血傳播風(fēng)險(xiǎn)，提升血液安全。

綜上所述，河源地區(qū)無償獻(xiàn)血者乙肝病毒感染標(biāo)志物檢出率較高，ELISA聯(lián)合NAT檢測(cè)有效降低了輸血傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)。從固定獻(xiàn)血人群及經(jīng)乙肝疫苗免疫的低年齡段人群采集血液，可有效降低輸血傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)。