與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期相關(guān)的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

徐曉文 何玉琪 張 露 潘名志 楊旭娜 惠 李 谷曉楚

1.江蘇省蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215008；2.江蘇省蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，江蘇蘇州 215008；3.江蘇省蘇州市廣濟(jì)醫(yī)院科教部，江蘇蘇州 215008

膠質(zhì)瘤是一種起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤[1]。根據(jù)病理評(píng)估，WHO將膠質(zhì)瘤分為低級(jí)別和高級(jí)別兩類，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤分化良好、多為良性、預(yù)后較好；而高級(jí)別膠質(zhì)瘤為未分化、惡性、預(yù)后較差，如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中位生存時(shí)間約為15個(gè)月[1]。癌癥和腫瘤基因圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是目前全球最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，提供不同種類癌癥基因突變、表達(dá)和甲基化等信息以及患者臨床資料，這為采用系統(tǒng)生物學(xué)方法研究腫瘤發(fā)生發(fā)展、識(shí)別決定多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素提供了研究資料[2]。本研究采用權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（Weighted Gene Co-Expression Network，WGCNA）分析構(gòu)建了多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并與患者生存期進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出與生存期顯著相關(guān)的共表達(dá)模塊，并進(jìn)一步利用通路富集分析軟件對(duì)模塊中的基因進(jìn)行通路分析，從而為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入的膠質(zhì)瘤患者臨床資料和膠質(zhì)瘤組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)全部從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄了148例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中男95例，女53例；確診年齡（60.0±13.5）歲，平均生存期12.4個(gè)月。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

共注釋得到了20 029種RNA表達(dá)量。為了減少計(jì)算量，排除了在少于20%的個(gè)體中表達(dá)的基因。通過(guò)預(yù)處理，保留了16 664個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本。采用R軟件平臺(tái)的 DESEQ 包對(duì)這些RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。

1.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將均一化后的表達(dá)數(shù)據(jù)以及臨床資料導(dǎo)入R軟件平臺(tái)，采用WGCNA軟件包構(gòu)建多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與臨床資料相關(guān)性分析

將獲得的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與患者生存期進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出與生存期強(qiáng)相關(guān)的共表達(dá)模塊。

1.5 通路分析

將篩選出模塊中的基因?qū)胪犯患治鲕浖﨏onsensus Path DB（http://consensuspath-db.org）在線進(jìn)行通路分析。

2 結(jié)果

2.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于膠質(zhì)瘤組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)共包括31個(gè)共表達(dá)模塊，處于同一個(gè)模塊中的基因具有類似表達(dá)模式（見(jiàn)圖1）。

圖1 基于膠質(zhì)瘤組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

2.2 不同共表達(dá)模塊與患者生存期相關(guān)性

暗寶石綠模塊與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期顯著相關(guān)（r=0.35，P＜0.01）。見(jiàn)圖2。在WGCNA中，特定基因表達(dá)量與臨床資料之間的相關(guān)性被定義為基因顯著性（Gene significance），而特定基因與模塊特征基因之間表達(dá)量上的相關(guān)性被定義為模塊身份（Module membership）。在暗寶石綠模塊中，基因顯著性與模塊身份顯著相關(guān)（r=0.44，P＜0.01）表明與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期顯著相關(guān)的基因也是該模塊的核心成員。見(jiàn)圖3。

圖2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者臨床資料的相關(guān)性分析

圖3 暗寶石綠顏色模塊中199個(gè)基因的基因顯著性與模塊身份的相關(guān)性分析

2.3 通路分析

199個(gè)基因主要富集于整合素、膠原蛋白、硫酸軟骨素等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路以及Wnt、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA）和伊立替康等代謝相關(guān)通路中。

3 討論

在本研究中，我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)構(gòu)建了權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并將獲得的31個(gè)共表達(dá)模塊與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期進(jìn)行相關(guān)分析，其中一個(gè)與生存期強(qiáng)相關(guān)的暗寶石綠模塊中的199個(gè)基因顯著富集于整合素、膠原蛋白、硫酸軟骨素等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路以及Wnt、EGFR、VEGF、uPA和伊立替康代謝等相關(guān)通路中。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)特殊的侵襲浸潤(rùn)生長(zhǎng)方式，是腦膠質(zhì)瘤顯著的病理學(xué)特征[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，有很多因子參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和浸潤(rùn)，如VEGF、uPA、整合素、硫酸軟骨素等[3-5]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤能夠自分泌VEGF，促進(jìn)腫瘤組織血管形成，從而更高效地向正常組織擴(kuò)散，維持腫瘤組織內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)[6]。uPA表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織邊緣，與膠質(zhì)瘤侵襲性密切相關(guān)，敲除uPA基因的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)喪失侵襲性[7]。整合素也是腫瘤侵襲生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，其通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原、硫酸軟骨素等相互作用，以及細(xì)胞間黏附和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移[8]。

Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的通路，參與調(diào)節(jié)包括胚胎器官發(fā)育在內(nèi)的多種過(guò)程，包括增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)行為[9]。在腦膠質(zhì)瘤病理過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)，并發(fā)揮多方面功能：如上調(diào)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤組織血管生成；促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲生長(zhǎng)，敲除Wnt1和Wnt3a能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移；抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)beta-catenin水平可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[10-12]。

EGFR是一種重要的原癌基因，是人表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，具有酪氨酸激酶活性，可促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖，參與腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、新生血管形成、侵襲與轉(zhuǎn)移，并可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[13-14]。在膠質(zhì)瘤患者中，約50%會(huì)出現(xiàn)EGFR擴(kuò)增、重排、突變和過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞異常增殖，且與膠質(zhì)瘤分級(jí)、惡性程度等呈正相關(guān)[15]。針對(duì)EGFR的靶向治療可能成為膠質(zhì)瘤治療的新方向[16]。

伊立替康作為一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，具有廣泛抗腫瘤活性，臨床主要用于結(jié)直腸癌、小細(xì)胞肺癌及卵巢癌等治療[17]。因伊立替康可透過(guò)血腦屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，因此在腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域具有一定潛力[18]。但伊立替康單藥治療膠質(zhì)瘤療效不甚理想，且易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[19]；與替莫唑胺、塞來(lái)昔布、舒尼替尼及貝伐單抗等聯(lián)用則顯示出較好抗腫瘤活性，提高康復(fù)率、延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期。

由于樣本收集困難，本研究未采用平行對(duì)照來(lái)驗(yàn)證生物信息學(xué)分析獲得的結(jié)果，這是本研究的不足。但作為探索性研究，我們?nèi)匀蝗〉昧艘恍┯幸饬x的結(jié)果。本研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)組學(xué)研究篩選出的基因集進(jìn)行深入分析，初步確定了與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路，并為今后多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤研究和臨床診治提供了一些思路和啟發(fā)。