薄層色譜與QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定2種食根蔬菜中5種酰胺類除草劑殘留量

方海仙， 耿慧春， 陳興連， 普婭麗， 劉宏程*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，云南昆明 650205；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)，云南昆明 650205；3.元江縣農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢測站，云南元江 653300)

本課題組前期研究[1,2]中采集的26個土壤樣品中酰胺類除草劑陽性樣品比率為42%。洋蔥和大蒜可食用部分生長在地下，該類蔬菜根系可能從土壤中吸收殘留的農(nóng)藥[3]。這兩種蔬菜富含蒜氨酸類物質，在完整的細胞中蒜氨酸以穩(wěn)定的形式存在于細胞質中，能分解蒜氨酸的蒜酶存在于液泡中，有細胞膜作為屏障兩者無法接觸，但當細胞遭到粉碎等破壞時，蒜氨酸與蒜酶接觸發(fā)生反應生成大量含硫化合物[4 - 6]，因此，農(nóng)藥殘留測定需要的粉碎均質樣品含有大量含硫化合物，這類化合物性質與農(nóng)藥相近，且含量遠遠高于農(nóng)藥含量，在農(nóng)藥殘留測定時造成很強的背景干擾。為了大蒜和洋蔥質量控制，酰胺類除草劑殘留測定方法的建立尤其重要。

目前，關于洋蔥和大蒜中農(nóng)藥的多殘留檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)及氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)等。其中，GC-MS/MS[7,8]具有快速、準確和靈敏等優(yōu)點，適用于基質較復雜的痕量化合物分析。QuEChERS方法由美國農(nóng)業(yè)部的Aanstassiades等人[9]提出，由于具有快速、簡單、經(jīng)濟、高效、抗干擾和安全的優(yōu)點，被廣泛應用于水果、蔬菜及其他基質農(nóng)藥殘留分析中。近年來新型碳納米材料的開發(fā)與應用成為研究的熱點，如石墨烯，多壁碳納米管[10 - 15](Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs)。其中MWCNTs由于具有與眾不同的機械性能、電子性能、化學性質和較大的比表面積的優(yōu)點，引起眾多科學研究領域的關注并得到了廣泛的應用。MWCNTs對有機物具備優(yōu)于其他吸附材料的吸附能力[16]，在農(nóng)藥殘留前處理過程中逐步得到應用。

本研究選用土壤中檢出率較高的乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺5種酰胺類除草劑為研究對象，建立其在洋蔥和大蒜中殘留分析方法。該方法結合薄層色譜顯色，分析目標化合物測定的干擾物，對凈化條件進行篩選，優(yōu)化前處理和檢測條件，建立QuEChERS-GC-MS/MS測定洋蔥和大蒜中5種酰胺類除草劑的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TRACE 1310 TSQ 8000型氣相色譜-三重四極桿質譜儀(配有電子轟擊電離(EI)源和AL 1310型自動進樣器)(美國，Thermo Scientific公司)；HY-5A振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(德國，海道爾夫公司)；電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；水浴氮吹儀(美國，Organomation N-EVAP公司)。

標準品：乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺(1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部天津環(huán)境保護科研監(jiān)測所)。多壁碳納米管(直徑>50 nm，長度：0.5～2 μm，純度>98%，中國科學院成都有機化學有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)(40 μm，美國Varian公司)；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)(40 μm，美國Varian公司)；石墨化碳黑(GCB)(40～120 μm，迪馬科技)；弗羅里矽(Florisil)固相萃取柱(1 g/6mL，美國Supelco公司)；正己烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；乙腈(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。NaCl、無水Na2SO4(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈-HAc(99∶1，V∶V)：移取10 mL冰HAc加入990 mL乙腈中，混勻。

硅膠G板(20 cm×20 cm，青島海洋化工)，點樣毛細管(100 mm×0.3 mm，華西醫(yī)科大學儀器廠)，薄層色譜展開缸(100 mm×200 mm)。改良碘化鉍鉀顯色劑：(A)取堿式硝酸鉍0.85 g，加冰HAc 10 mL與水40 mL溶解；(B)取KI 8 g，加水20 mL溶解。將A、B溶液混合，搖勻，即可。

1.2 樣品前處理

稱取10 g(精確至0.01 g)勻漿后的樣品至50 mL帶蓋聚丙烯離心管中，洋蔥樣品加入10.0 mL HAc-乙腈，大蒜樣品加入10.0 mL乙腈、2 g NaCl，渦旋振蕩器渦旋10 s，振蕩提取30 min，以5 000 r/min離心10 min，得到提取液。取6.0 mL洋蔥提取液于預先加入150 mg PSA+12 mg MWCNTs+ 36 mg GCB填料的離心管中，取6.0 mL大蒜提取清液于預先加入270 mg PSA+24 mg MWCNTs+ 12 mg C18填料的離心管中，渦旋振蕩器渦旋10 s，取上清液4.0 mL，置于燒杯中，水浴加熱并通入氮氣，吹干溶劑，加入2.0 mL丙酮溶解，在渦旋振蕩器上渦旋10 s，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3 溶液的配制及標準曲線的繪制

1.3.1 標準儲備溶液分別移取乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺1.0 mL，用正己烷定容至25.0 mL，配制成單一標準儲備溶液，貯存在-20 ℃冰箱中。準確吸取一定體積各單一標準儲備液，用正己烷定容至25.0 mL，得到5種酰胺類除草劑的混合標準溶液，貯存在-4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 標準曲線繪制取勻漿后的洋蔥和大蒜樣品，按“1.2”方法進行前處理，分別制得空白洋蔥和大蒜基質溶液。將上述混合標準溶液用空白洋蔥基質和空白大蒜基質溶液稀釋成0.02、0.1、0.2、1.0、2.0 μg/mL的系列混合標準溶液。按“1.4”條件測定，采用外標法定量。以標準溶液的峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標繪制工作曲線。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：DB-17ms石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氮氣(純度≥99.999%)，恒流模式，柱流速為1.0 mL/min；進樣量：1.00 μL，不分流進樣，進樣口溫度：230 ℃；柱溫升溫程序：初始溫度70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。

1.4.2 質譜條件電離方式：EI源；離子源溫度：300 ℃；質譜傳輸線溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%)；掃描模式：選擇離子掃描。

2 結果與討論

2.1 薄層色譜鑒別

分別取40 μg/mL甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺標準溶液2.5 mL，氮氣吹干后，加入100 μL丙酮復溶，得到1.0 mg/mL供試標準品溶液。分別稱取勻漿后大蒜樣品和洋蔥樣品各10 g，加入20 mL乙腈，4 g NaCl，渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min后，5 000 r/min離心3 min，使乙腈相與水相分層，取2.0 mL上清液，氮氣吹干，加入100 μL丙酮復溶，即得。

以正己烷-丙酮(4∶1)為展開劑，展開后，取出晾干。碘化鉍鉀顯色(圖1)。由圖1a可知，5個化合物碘化鉍鉀，反應顯紅色，得到的斑點清晰，其中異丙甲草胺比移值Rf=0.46，甲草胺、乙草胺和丙草胺的為Rf=0.53，丁草胺為Rf=0.63，基于此，與樣品對比時，選擇乙草胺作為代表。

圖1 標準品和樣品薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatogram(TLC) of standard (a) and sample (b)1.alachlor;2.acetochlor;3.pretilachlor;4.butachlor;5.metolachlor;6.garlic;7.onion.

由圖1b可知，大蒜成分復雜，對5種化合物測定干擾較大，在5個目標化合物附近，有較大不成型的斑點，而洋蔥相對干擾較小，因此，殘留測定時前處理過程尤其重要。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

配制2.0 μg/mL的目標化合物標準溶液在m/z50～550范圍內進行全掃描，根據(jù)色譜圖及全掃描譜圖，得出各目標農(nóng)藥的保留時間后，采用Auto SRM模式進行質譜條件優(yōu)化，得到母離子全掃描譜圖，選擇分子離子峰或相對豐度較高的特征碎片峰作為母離子，鎖定母離子后，采用離子掃描方式進行二級質譜分析，獲得子離子全掃描譜圖，選擇豐度較高的合理斷裂碎片離子作為子離子，在Targeted模式下優(yōu)化碰撞能量，選擇離子豐度最高、基質干擾最小的三個離子對作為特征離子對，其中響應最高的離子對作為定量離子，最終確定的母離子、子離子和碰撞能量詳見表1。

表1 目標化合物多反應監(jiān)測(SRM)質譜參數(shù)

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

傳統(tǒng)QuEChERS[18]方法采用乙腈或者乙腈-HAc溶液(99+1)為提取溶劑；正己烷提取極性較小的農(nóng)藥，具有較高的提取效率。本實驗的5種酰胺類除草劑的極性較弱，因此，比較了乙腈、乙腈-HAc溶液(99+1)、正己烷三種溶劑的提取效率。結果表明：用正己烷和乙腈提取洋蔥中目標農(nóng)藥時，回收率偏高，用乙腈-HAc提取時，回收率在93%～105%之間，因此，洋蔥基采用乙腈-HAc為提取溶劑。而在大蒜中，用正己烷提取目標農(nóng)藥時，提取效率低，回收率偏低，乙腈-HAc提取時，回收率偏高，乙腈提取時，回收率在101%～105%之間，因此，大蒜采用乙腈為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 PSA用量洋蔥[19]中含有葡萄糖、木糖、半乳糖等多糖，以及咖啡酸、芥子酸和阿魏酸等有機酸；大蒜[20]中含有葡萄糖、半乳糖和果糖等單糖，蔗糖、果糖和棉子糖等低聚糖，半乳聚糖、雜果聚糖和果聚糖等多聚糖，這些物質在前處理過程中的不進行凈化，后續(xù)過程會產(chǎn)生較大的干擾。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg三個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的PSA(15 mg,25 mg,35 mg,45 mg,55 mg)，比較不同用量的PSA對回收率的影響。

從圖2和圖3可以看出：洋蔥中隨著PSA的增多，5種目標農(nóng)藥有明顯的吸附作用，回收率下降，為滿足回收率的要求選擇25 mg/mL作為PSA的量；大蒜中隨著PSA用量的增加，丙草胺的回收率升高，其余4種目標農(nóng)藥基本不吸附，當PSA用量為45 mg/mL時，丙草胺的回收率最低為110%，因此，大蒜基質中選擇PSA的用量為45 mg/mL。

2.4.2 MWCNTs用量MWCNTs是一種良好的吸附材料，可通過π-π作用力和分子間相互作用力[21]等方式與目標物結合，可有效去除色素、疏水性物質，具有較好的凈化效果。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg的3個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的多壁碳納米管(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的MWCNTs對凈化效果及回收率的影響(圖2，圖3)。結果表明，洋蔥中隨著MWCNTs用量增加，對目標農(nóng)藥依舊沒有明顯吸附作用，回收率偏高，當添加量為2 mg/mL時，已經(jīng)滿足回收率要求；大蒜中回收率偏高，當用量為4 mg/mL時滿足回收率要求。因此，最終確定MWCNTs的用量為洋蔥選2 mg/mL，大蒜選4 mg/mL。

2.4.3 GCB用量GCB去除類胡蘿卜素、葉綠素等色素化合物，洋蔥基質富含矢車菊色素和飛燕草色素等花青素類色素[22]，使提取液顏色較深。為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg 3個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的GCB(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的GCB對凈化效果及回收率的影響。圖2可以看出，GCB對異丙甲草胺的影響較大，回收率偏高，綜合其他幾種農(nóng)藥的回收率，最終確定洋蔥中GCB的用量為6.0 mg/mL。

圖2 不同凈化材料對洋蔥基質中5種農(nóng)藥的添加回收率影響Fig.2 Effect of different purification materials on recovery of 5 pesticides for extraction of onion

2.4.5 C18用量C18用于去除脂肪和脂類等非極性化合物。大蒜中含有中性脂質、糖脂和磷脂等脂類化合物[20]，對農(nóng)藥殘留分析造成了較大的干擾，為了獲得最佳的凈化效果及回收率，在添加濃度為0.1 mg/kg三個平行樣品每毫升提取液凈化過程中加入不同量的C18(2 mg,4 mg,6 mg,8 mg,10 mg)，比較不同用量的 C18對凈化效果及回收率的影響。圖3可以看出：當C18用量為2 mg/mL時，5種目標農(nóng)藥的回收率已經(jīng)滿足要求，因此，最終確定大蒜中C18用量為2 mg/mL。

圖3 大蒜基質不同凈化材料對5種農(nóng)藥的添加回收率影響Fig.3 Effect of different purification materials on recovery of 5 pesticides for extraction of garlic

綜上所述，為了使前處理方法的凈化效率達到最佳，同時保證回收率、降低成本，確定洋蔥每毫升提取液中加入25 mg PSA + 2 mg MWCNTs + 6 mg GCB，大蒜樣每毫升提取液中加入45 mg PSA + 4 mg MWCNTs + 2 mg C18。

2.5 基質效應

分別配制相同濃度梯度的溶劑標準溶液和基質標準溶液，兩者采用同一個混合標準溶液進行稀釋配制，僅配制溶劑不同。溶劑標準溶液采用純溶劑進行配制，基質標準溶液采用前處理方法制備好的空白洋蔥和大蒜基質溶液進行配制，基質效應按照文獻方法[17]進行計算。結果列于表2。

5種農(nóng)藥在優(yōu)化色譜和質譜條件下的定量離子圖如圖4所示。

圖4 5種農(nóng)藥定量離子Fig.4 Quantification ion of five pesticides1.acetochlor;2.alachlor;3.metolachlor;4.butachlor;5.pretilachlor.

2.6 方法的線性范圍和定量限

在0.02～2.0 μg/mL線性范圍內，以5種農(nóng)藥的質量濃度與對應的峰面積進行線性回歸分析，如表2所示。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)計算定量限(LOQ)。5種酰胺類除草劑的線性關系良好，檢出限均為0.0075 mg/kg，定量限均為0.025 mg/kg。

從表2可以看出，5種目標農(nóng)藥在洋蔥樣品中都表現(xiàn)出弱基質抑制效應，且基質效應不明顯；在大蒜樣品中表現(xiàn)為基質增強效應，其中乙草胺和甲草胺表現(xiàn)為弱基質增強效應，丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺表現(xiàn)為中等基質增強效應。因此，準確定量時，需要配制基質標準溶液來進行。

表2 5種酰胺類除草劑的基質效應、線性方程、相關系數(shù)和線性范圍

2.7 方法的準確度和精密度

分別稱取不含5種酰胺類除草劑殘留的洋蔥和大蒜樣品各19份，每份10.00 g，其中1份為對照，另外18份樣品分為3組，每組6份。第1組每份均加入5種酰胺類除草劑混合標準溶液，使樣品中5種酰胺類除草劑的含量為0.025 mg/kg；第2組添加5種酰胺類除草劑混合標準溶液后的含量為0.1 mg/kg；第3組添加5種酰胺類除草劑混合標準溶液后的含量為0.25 mg/kg，分別將上述樣品充分混勻，放置30 min。在最優(yōu)前處理條件和儀器條件下，進行回收率和精密度試驗，每個添加水平做6個平行樣品，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)，結果如表3所示。

表3 5種酰胺類除草劑的回收率、精密度、檢出限、定量限

(續(xù)表3)

5種酰胺類除草劑在洋蔥中的平均回收率為82.8%～102%，RSD為2.08%～7.90%，大蒜中平均回收率為72%～98.8%，RSD為0.524%～5.96%，說明該方法能達到農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結論

乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺和丙草胺為常用的酰胺類除草劑，本課題組前期研究土壤時發(fā)現(xiàn)此類農(nóng)藥容易檢出，大蒜和洋蔥為食根蔬菜，該類蔬菜根系可能從土壤中吸收本來就殘留的農(nóng)藥。因此，該類農(nóng)藥在大蒜和洋蔥中檢測方法的開發(fā)與應用尤其重要。通過優(yōu)化展開劑配比、顯色條件，對5種目標農(nóng)藥進行薄層色譜鑒別，碘化鉍鉀顯色改良后，洋蔥和大蒜提取液對5種目標農(nóng)藥干擾較大，因此，洋蔥和大蒜前處理很重要。采用改良QuEChERS法進行前處理，優(yōu)化前處理條件、色譜條件和質譜條件，實驗結果顯示，5種酰胺類除草劑加標回收率結果較好，精密度和重現(xiàn)性滿足日常檢測農(nóng)藥殘留分析要求。