芒果苷3種晶型在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)*

楊海光，趙贏，楊世穎，方蓮花，宋俊科，呂揚(yáng)，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所1.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

芒果苷( mangiferin，1，3，6，7-tetrahydroxyxanthone-C2-β-D-glucoside)又稱知母寧、芒果素，主要從漆樹科和龍膽科植物的葉、莖、果實(shí)、樹皮中提取得到，也是中藥知母的主要活性成分。其結(jié)構(gòu)由氧雜蒽酮的苷元和1個(gè)葡萄糖以糖苷鍵的形式相連而成，屬于多酚酸類化合物。近年來，國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)道芒果苷廣泛的藥理學(xué)活性，包括治療糖尿病及其并發(fā)癥[1]、調(diào)節(jié)脂代謝異常[2]、抗腫瘤[3]、心血管保護(hù)[4]、抗高尿酸血癥[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、解熱和鎮(zhèn)痛[9]、抗菌、抗病毒[10]、抗輻射、保肝、促進(jìn)骨骼發(fā)育、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的可能性。固體化學(xué)藥物的多晶型現(xiàn)象是一種普遍存在的自然現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是指一種固體化學(xué)藥物可以存在≥2種不同固體物質(zhì)存在狀態(tài)，又稱為“同質(zhì)異晶”現(xiàn)象[11]。同一種藥物的不同晶型物質(zhì)在溶解度、溶出速率、熔點(diǎn)、密度、硬度、外觀以及生物有效性等方面可能存在較大差異，從而影響藥物的穩(wěn)定性、生物利用度及療效的發(fā)揮[12]。為了確定芒果苷的優(yōu)勢(shì)藥物晶型，筆者在制備芒果苷3種晶型的基礎(chǔ)上，利用固體給藥的方法，采用大鼠進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試藥

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g，購自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0004。自由攝食飲水。

1.2儀器 d/max-2550粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)，固體灌胃器(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心研制)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1200-6110 系列，G1379B 在線脫氣機(jī)，G1311A 四元梯度泵，G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315DDAD 檢測(cè)器及系統(tǒng)控制器，G1316A 柱溫箱，6110 單四級(jí)桿質(zhì)譜儀，ESI 離子源，美國(guó)Agilent 公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman 公司，型號(hào)：AllegraTM X-22R)，漩渦混勻器(上海凡勁儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：Vortex-2)，氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司)，微量移液器(德國(guó)Eppendorf 公司)。

1.3試藥 芒果苷晶Ⅱ型、晶Ⅴ型、晶Ⅵ型3種晶型(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物晶型中心提供)，頭孢呋辛鈉對(duì)照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，甲酸(Fisher，質(zhì)譜純)，甲醇、乙酸乙酯(北京化工試劑公司，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1粉末X射線衍射 取樣品100 mg，研磨過孔徑0.150 mm(100目)篩，精密稱取50 mg，進(jìn)行X射線粉末衍射實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)條件：CuKa輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，2θ掃描范圍3°～80°，掃描速度8°·min-1，步長(zhǎng)0.02°。狹縫條件：發(fā)散狹縫為1°，限高狹縫為10 mm，防散射狹縫為1°，接收狹縫為0.30 mm。粉末X射線衍射分析結(jié)果表明，3種晶型物質(zhì)的衍射峰的位置、強(qiáng)度、拓?fù)鋱D形均存在明顯差異，其中晶Ⅱ型與晶Ⅵ型為晶態(tài)晶型，二者分子有序排列規(guī)律不同，晶Ⅴ型為無定型態(tài)物質(zhì)。見圖1。

A.晶Ⅱ型；B.晶Ⅴ型；C.晶Ⅵ型

2.2液質(zhì)條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸溶液(30：70)，流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，質(zhì)譜信號(hào)為ESI 源( 正離子檢測(cè)模式)，用于定量分析的離子荷質(zhì)比為445(芒果苷)、447(內(nèi)標(biāo)，頭孢呋辛鈉)，裂解電壓150 V，90 V，增益系數(shù)為1.5。干燥氣流為11.0 L·min-1，噴霧室電壓為35 psi，干燥器溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為3000 V(正)、3000 V(負(fù))。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加入50%甲醇1 mL充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1的芒果苷母液，臨用時(shí)以50%甲醇溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取頭孢呋辛鈉1 mg，加入甲醇1 mL充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1的頭孢呋辛鈉母液，臨用時(shí)以50%甲醇溶液稀釋成1.5 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4血漿樣品處理 精密吸取肝素抗凝血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉工作液和1.2 mol·L-1鹽酸溶液各10 μL，再加入乙酸乙酯1 mL，充分震蕩5 min，12 100×g，10 min，取上層溶液950 μL置于離心管中，常溫以氮?dú)獯蹈?。加?0%甲醇溶液70 μL復(fù)溶，震蕩5 min，12 100×g離心5 min，取上層溶液60 μL于內(nèi)襯管中，進(jìn)樣10 μL。以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行定量分析。

2.5方法專屬性考察 分別對(duì)空白血漿樣品，芒果苷和內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉工作液，空白血漿樣品加入芒果苷和內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉工作液，大鼠灌胃芒果苷后血漿樣品進(jìn)行處理并測(cè)定。按照“2.4”項(xiàng)下血漿處理方法處理樣品，芒果苷保留時(shí)間為4.1 min，內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉保留時(shí)間為5.9 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)芒果苷和內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉的色譜峰沒有干擾，說明該方法專屬性良好。LC-MS專屬性考察見圖2。

2.6線性關(guān)系考察及最低定量限 用不同濃度的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)液分別配制濃度為12.5，25，50，100，200，400，800，1000，1200，1600 μg·L-1的系列血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下血漿處理方法處理樣品，重復(fù)4次，以芒果苷峰面積(Ai)與頭孢呋辛鈉峰面積(As)的比值(Y)對(duì)芒果苷濃度(X，μg·L-1)作線性回歸，得回歸方程為Y= 0.0013X+ 0.0541，R2= 0.9991。結(jié)果表明芒果苷在12.5～1600 μg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為12.5 μg·L-1。

2.7精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 按照“2.4”項(xiàng)對(duì)低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品進(jìn)行處理并測(cè)定。一天之內(nèi)重復(fù)5次，連續(xù)測(cè)定3 d。以測(cè)得的芒果苷濃度計(jì)算方法的精密度。結(jié)果見表1，芒果苷血漿樣品的日內(nèi)精密度RSD為1.75%～6.56%，準(zhǔn)確度RE為-1.99%～8.08%；日間精密度RSD為1.06%～3.61%，準(zhǔn)確度RE為-2.14%～9.00%，滿足測(cè)定要求。見表1。

A.空白血漿；B.空白血漿加入芒果苷和頭孢呋辛鈉；C.灌胃芒果苷晶Ⅱ型后15 min血液加入頭孢呋辛鈉后處理血漿樣品；1.頭孢呋辛鈉；2.芒果苷

圖2芒果苷和內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛鈉血漿LC-MS圖

A.blank plasma sample；B. blank plasma spiked with mangiferin and cefluroxime； C. plasma sample collected at 15 min after oral adminitration of mangiferin (formⅡ) and spiked with cefluroxime；1.cefluroxime；2.mangiferin

Fig.2LC-MSchromatogramofplasmasamplecontainingmangiferinandcefluroxime

表1 芒果苷血漿樣品的日內(nèi)和日間精密度

Tab.1 Intra-day and inter-day precision for mangiferin in plasma sample

表1 芒果苷血漿樣品的日內(nèi)和日間精密度

時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)濃度/(μg·L-1)測(cè)定濃度/(μg·L-1)準(zhǔn)確度(RE)精密度(RSD)%日內(nèi) 2527.02±1.778.086.56 400392.04±7.10-1.991.81 12001225.18±21.522.101.75日間 2527.25±2.939.001.06 400391.43±5.22-2.141.33 12001176.98±42.53-1.923.61

2.8萃取回收率與加樣回收率 取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品，按“2.4” 項(xiàng)血漿樣品的處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行LC-MS 分析，記錄峰面積，與相應(yīng)濃度芒果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL 所得到的峰面積相比，二者比值即萃取回收率，重復(fù)5次。取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品，按“2.4” 項(xiàng)血漿樣品的處理方法進(jìn)行處理，利用血漿樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入線性方程，計(jì)算檢出量，檢出量與加入量的比值即為方法回收率，重復(fù)5次。結(jié)果見表2，芒果苷血漿樣品萃取回收率為85.01%～96.81%，RSD為1.53%～5.41%；方法回收率為98.01%～108.08%，RSD為1.75%～6.56%，符合方法學(xué)要求。見表2。

表2 芒果苷血漿樣品的回收率

Tab.2 Recovery of mangiferin in plasma sample

表2 芒果苷血漿樣品的回收率

給藥濃度/(μg·L-1 )萃取回收率回收率RSD方法回收率回收率RSD2596.81±1.481.53108.08±7.106.5640089.90±4.875.4198.01±1.771.81120085.01±3.614.25102.09±1.791.75

2.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)的血漿樣品，考察在室溫放置4 h，冰中放置4 h，-20 ℃放置7 d的穩(wěn)定性，每項(xiàng)3個(gè)濃度各重復(fù)5個(gè)。按“2.4” 項(xiàng)血漿樣品的處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行HPLC-MS分析。結(jié)果見表3，芒果苷含藥血漿在以上貯存條件下穩(wěn)定性良好，能夠滿足測(cè)定要求。

表3 芒果苷血漿穩(wěn)定性

Tab.3 Stability of mangiferin in plasma sample

表3 芒果苷血漿穩(wěn)定性

儲(chǔ)存條件與標(biāo)準(zhǔn)濃度/(μg·L-1)測(cè)定濃度/( μg·L-1)準(zhǔn)確度(RE)精密度(RSD)%室溫放置4 h 2525.79±3.023.1611.73 400400.4±16.350.104.08 12001217.65±2.781.470.23冰中放置4 h 2527.00±0.238.000.84 400452.40±10.7713.102.38 12001285.65±20.787.141.62-20 ℃放置7 d 2526.94±3.837.7614.21 400443.73±19.3810.934.36 12001255.25±73.644.605.87

2.10大鼠對(duì)不同晶型芒果苷的吸收 將SD大鼠隨機(jī)分組，每組5只，常規(guī)條件飼養(yǎng)，自由飲水，禁食12 h后按照100 mg·kg-1給予不同晶型的芒果苷。于給藥后15，30 min和1，1.5，2，3，4，5，7，9，12，24 h眼后靜脈叢取血約0.4 mL，至肝素化抗凝管，4 500×g，4 ℃離心10 min，取上層血漿凍存于-20 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。按照“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行樣品處理與測(cè)定，計(jì)算芒果苷血藥濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖3。

2.11主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 利用軟件DAS3.0.7對(duì)測(cè)得的芒果苷血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算(非房室模型法)。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，大鼠口服芒果苷不同晶型物質(zhì)后在體內(nèi)同一時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度存在一定差異，表明芒果苷晶型狀態(tài)對(duì)大鼠體內(nèi)的吸收量和吸收速率產(chǎn)生一定的影響。大鼠分別口服3種晶型芒果苷后，均在1 h內(nèi)血藥濃度達(dá)到峰值，其中晶Ⅴ型峰面積AUC(0-24 h)最大，峰濃度Cmax最高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[13-14]，對(duì)萃取和流動(dòng)相條件進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、高效、結(jié)果可靠的大鼠血漿芒果苷測(cè)定方法。在血漿樣品中加入少量鹽酸溶液，可有效提高乙酸乙酯對(duì)藥物的萃取效率。在流動(dòng)相中加入甲酸調(diào)節(jié)極性，使出峰時(shí)間較為合理，有效分開藥物峰與血漿雜質(zhì)峰。

通過該方法對(duì)芒果苷不同晶型物質(zhì)大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行考察，比較芒果苷不同晶型物質(zhì)在大鼠體內(nèi)的代謝過程。對(duì)于口服固體晶型藥物在體內(nèi)生物活性的研究，關(guān)鍵在于如何保證化合物在給藥過程中的晶型保持不變。藥物不同晶型物質(zhì)在完全溶解后進(jìn)入體內(nèi)，一般不再具有吸收的差異，即使采用混懸的方式給藥，由于藥物本身存在一定的溶解度及與溶液接觸等因素，可能導(dǎo)致晶型發(fā)生改變，不能準(zhǔn)確反映晶型物質(zhì)的真實(shí)吸收特點(diǎn)，從而影響優(yōu)勢(shì)藥物晶型的選擇[15]。本實(shí)驗(yàn)采用小動(dòng)物固體灌胃器，可以定量地將藥物以固體形式灌胃給予大鼠，從而有效考察不同晶型物質(zhì)在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，保證生物學(xué)評(píng)價(jià)的真實(shí)性、有效性與準(zhǔn)確性。

表4 芒果苷3種晶型物質(zhì)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Tab.4 Pharmacokinetic parameters of three kinds of mangiferin polymorphs

表4 芒果苷3種晶型物質(zhì)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

分型AUC(0-24 h)/(ng·mL-1·h)Cmax/( μg·L-1)tmaxt1/2MRT0-thCLz/F/(L·h-1·kg-1)晶Ⅱ型1 323.27±218.07321.92±85.180.70±0.452.78±1.725.28±0.9676.00±13.28晶Ⅴ型1 974.34±469.24455.83±277.070.50±0.325.29±2.676.41±0.9846.34±20.15晶Ⅵ型1 737.79±623.06319.92±86.070.50±0.345.31±2.827.10±0.7460.47±23.67

優(yōu)勢(shì)藥物晶型是指在固體化學(xué)藥物存在多種晶型狀態(tài)的情況下，其中穩(wěn)定性符合藥用要求、臨床療效最佳、安全性最高、最適合用于制備藥品的晶型狀態(tài)。符合優(yōu)勢(shì)藥物晶型的重要條件包括具有良好的生物學(xué)活性和臨床治療效果，穩(wěn)定性符合制藥要求，制備工藝可實(shí)施，質(zhì)量可控[11]。當(dāng)然，優(yōu)勢(shì)藥物晶型物質(zhì)狀態(tài)可以是一種或多種，可選擇一種晶型作為藥用晶型物質(zhì)，亦可按一定比例選擇兩種或多種晶型物質(zhì)的混合狀態(tài)作為藥用晶型物質(zhì)使用[16]。芒果苷3種晶型物質(zhì)AUC(0-24 h)為1323.27～1737.79 ng·mL-1·h，tmax為0.5～0.7 h，Cmax為319.92～455.83 μg·L-1。比較以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芒果苷3種晶型出現(xiàn)不同的藥物吸收，各晶型物質(zhì)藥動(dòng)學(xué)差異明顯，其中晶Ⅴ型芒果苷AUC(0-24 h)和Cmax最大，可能成為芒果苷潛在的優(yōu)勢(shì)藥物晶型。