冷飯團對肝纖維化大鼠肝組織Bcl-2和Bax及PCNA表達的影響*

徐衛(wèi)權，李艷

(湖北省宜昌市夷陵醫(yī)院藥劑科，宜昌 443100)

冷飯團為五味子科南五味子屬植物冷飯團[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]的根和藤莖，主要分布在我國湖北、廣東、廣西、四川、云南、貴州等地。其味辛、微苦，性溫。具有行氣鎮(zhèn)痛、散瘀通絡的功效，主要用于治療風濕痹痛、跌打損傷、胃病及婦科病等[1]。據(jù)研究，冷飯團具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗人獲得性免疫缺陷病毒(HIV )等廣泛的藥理活性，并有較好的抗肝纖維化作用[2-3]。筆者在本研究旨在通過觀察冷飯團對四氯化碳(CCl4)誘導實驗性肝纖維化大鼠肝組織Bcl-2、Bax及增殖細胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen，PCNA)表達的影響，進一步探討冷飯團的抗肝纖維化作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康SD大鼠，雌雄兼用，體質量180～200 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0007。動物飼養(yǎng)室相對濕度50%～70%，溫度20～23 ℃，大鼠自由飲水、攝食。

1.2藥物與試劑 冷飯團[采自湖北省宜昌市夷陵區(qū)，經(jīng)李文勝主任藥師鑒定為五味子科植物冷飯團Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的藤莖]，切薄片，干燥，水煎2次，每次60 min，濾過，合并濾液，置水浴上濃縮至每毫升含生藥0.25 g和0.5 g。秋水仙堿片(云南植物藥業(yè)有限公司，批號：160713)，臨用時研末，加純化水配制成0.02 mg·mL-1混懸液。四氯化碳(鄭州化學試劑二廠，批號：151109)。免疫組織化學一抗(兔抗大鼠多克隆抗體Bcl-2、兔抗大鼠多克隆抗體Bax、小鼠抗大鼠單克隆抗體PCNA，武漢博士德生物工程有限公司，批號：20160917)。免疫組織化學二抗(SAl021-小鼠IgG、SAl022-兔IgG、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號：20160917)。

1.3動物分組 將健康SD大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組、冷飯團小劑量組、冷飯團大劑量組，每組12只。

1.4造模及給藥 大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，除正常對照組外，其余大鼠皮下注射40%四氯化碳橄欖油溶液0.3 mL·(100 g)-1，每周星期一和星期四各注射1次，共6周。在實驗過程中，除正常對照組大鼠用全價顆粒飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠先用79.5%純玉米粉、20%豬油和0.5%膽固醇制成的顆粒飼料喂養(yǎng)2周，再用89.5%純玉米粉、10%豬油和0.5%膽固醇制成的顆粒飼料喂養(yǎng)至第6周末。同時灌服30%乙醇1 mL·(100 g)-1，每周2次，共6周。從實驗第2天開始，均按10 mL·kg-1劑量灌胃給藥，每日1次，共6周。其中，秋水仙堿組灌服0.02 mg·mL-1秋水仙堿混懸液，冷飯團小、大劑量組分別灌服0.25，0.5 g·mL-1冷飯團水煎液，正常對照組和模型對照組灌服等容積0.9%氯化鈉溶液。

1.5檢測指標及方法 實驗第6周末，處死各組大鼠，仰臥位固定，在無菌操作下切開腹腔，摘取肝左葉組織，置于10%甲醛溶液中固定。固定后組織用流水沖洗，使用乙醇從低濃度到高濃度的順序進行脫水，透明，石蠟包埋切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶連接法(S-P)，用已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。按試劑盒內(nèi)說明書操作，對各組大鼠肝組織切片進行免疫組織化學染色。利用JEDA-801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)分別計算Bcl-2、Bax和PCNA免疫組織化學染色的陽性面積百分比。病理切片做蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學的變化和膠原纖維增生情況。

2 結果

2.1動物一般情況 除模型對照組大鼠死亡2只外，其余各組大鼠均存活。正常對照組大鼠生長良好，體質量自然增長，行走、活動、食欲和排便均正常。模型對照組大鼠生長受抑，體質量下降，活動減少，飲食下降。各治療組大鼠生長較正常，體質量略有增長，活動較靈敏，反應較敏捷，飲食較正常。

2.2大鼠肝組織病理學觀察 HE染色標本觀察，正常對照組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，無變性壞死。模型對照組大鼠肝小葉結構嚴重破壞，肝細胞廣泛脂肪變性，大部分標本可見不同程度的肝細胞壞死，肝組織中有炎癥細胞浸潤。秋水仙堿組肝細胞脂肪變性，匯管區(qū)及肝小葉可見少量炎癥細胞浸潤。冷飯團小劑量組和大劑量組肝小葉結構基本正常，肝小葉周邊肝細胞有輕度脂肪變性，匯管區(qū)偶見少量淋巴細胞浸潤。其肝細胞水腫、脂肪變性程度均比模型對照組輕。Masson染色標本觀察，模型對照組大鼠肝組織內(nèi)有大量纖維組織增生形成纖維間隔，膠原纖維從匯管區(qū)向肝小葉內(nèi)延伸，其破壞界板，分割、包繞肝小葉，部分標本內(nèi)可見完整的假小葉。秋水仙堿組肝組織內(nèi)膠原纖維增生均比模型對照組輕，無假小葉形成。冷飯團小劑量組和大劑量組部分標本有輕度纖維組織增生，主要散在于中央靜脈和匯管區(qū)。見圖1。

2.3肝組織中Bcl-2、Bax和PCNA的表達 Bcl-2和Bax蛋白免疫組化的陽性表達呈棕黃色或深棕黃色，PCNA陽性著色呈棕黃色細顆粒狀。見圖2。模型對照組大鼠肝組織中Bcl-2、Bax和PCNA的表達均明顯高于正常對照組(P<0.01)；與模型對照組比較，冷飯團大、小劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中Bax蛋白的表達明顯降低，PCNA的表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)途徑，及時診斷與治療肝纖維化對阻止肝硬化的發(fā)生、改善慢性肝病的預后具有重要意義。四氯化碳誘導的肝纖維化動物模型，是抗肝纖維化藥物篩選及肝纖維化機制研究的理想模型，其病理改變與人類肝纖維化的形態(tài)特征相似[4]。本實驗結果表明，大鼠經(jīng)四氯化碳和高脂低蛋白等復合因素刺激6周后，其肝小葉結構被破壞，肝組織內(nèi)出現(xiàn)廣泛脂肪變性和炎性細胞浸潤，纖維組織不同程度增生并將肝組織分成廣泛的假小葉，說明大鼠肝纖維化模型復制成功。經(jīng)秋水仙堿或冷飯團干預后，大鼠肝細胞壞死、肝臟脂肪變性、炎性細胞浸潤和膠原纖維增生程度均不同程度地減輕。說明冷飯團具有一定的抗大鼠實驗性肝纖維化作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.秋水仙堿組；D.冷飯團小劑量組；E.冷飯團大劑量組

A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.low-doseKadsuracoccineagroup；E.high-doseKadsuracoccineagroup

Fig.1Massonstainingimagesoflivertissuesinfivegroupsofrats(×50)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.秋水仙堿組；D.冷飯團小劑量組；E.冷飯團大劑量組

A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.low-doseKadsuracoccineagroup；E.high-doseKadsuracoccineagroup

Fig.2Immunohistochemicalstainingoflivertissueinfivegroupsofrats(×400)

肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及轉歸與細胞凋亡和增殖有關。細胞凋亡是受多基因控制的過程，其中Bcl-2家族是目前最受重視的凋亡相關基因家族。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2基因家族，Bcl-2基因和Bax基因的相關蛋白Bcl-2蛋白和Bax蛋白可形成異源二聚體，Bax蛋白之間形成同源二聚體，且異源二聚體抑制細胞凋亡，而同源二聚體則促進細胞凋亡[5-7]。因此，Bcl-2和Bax兩種蛋白之間的比值決定細胞的凋亡狀態(tài)，若調高Bax/Bcl-2比值則促進細胞凋亡，而降低Bax/Bcl-2比值則抑制細胞凋亡。PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種核蛋白，其合成與表達反映細胞的增殖狀態(tài)。細胞動力學研究表明，PCNA的表達及合成與細胞增生周期有關，G1期PCNA逐漸增多，S期達高峰。因此，PCNA能準確地反映細胞的生長速度和狀態(tài)，其表達上調則促進細胞的增殖[8]。本研究結果表明，肝纖維化模型大鼠肝組織中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達較正常大鼠顯著升高，結果與文獻[9]報道一致。提示肝組織在受到四氯化碳等因素的損傷刺激后，引起B(yǎng)ax的表達增加來誘導肝細胞的凋亡。在肝細胞發(fā)生凋亡后，機體可能通過代償機制增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來對抗凋亡。經(jīng)冷飯團或秋水仙堿干預后，大鼠肝組織中Bax蛋白的表達明顯降低，Bax/Bcl-2比值降低，PCNA的表達顯著升高。提示在冷飯團的干預下，肝細胞的凋亡減少，細胞的增殖速度加快，這有利于肝細胞的修復和維持數(shù)量的穩(wěn)定，從而使肝細胞炎癥減輕，肝纖維化進程得到遏制。因此，筆者認為冷飯團可能通過影響肝組織中Bax和PCNA的表達來調節(jié)肝細胞的凋亡和增殖水平，從而抑制和逆轉肝纖維化。

表1 5組大鼠肝組織中Bcl-2、Bax和PCNA的表達

Tab.1 Expression of Bcl-2， Bax and PCNA of liver tissues in five groups of rats

表1 5組大鼠肝組織中Bcl-2、Bax和PCNA的表達

組別動物數(shù)/只劑量/(g·kg-1)Bcl-2BaxPCNA正常對照組12-3.69±1.07?13.97±0.84?15.53±1.12?1模型對照組10-7.63±1.328.55±2.019.17±2.25秋水仙堿組120.00026.37±1.81 5.76±1.47?213.56±3.04?1冷飯團 小劑量組122.56.42±1.59 5.59±1.53?214.89±2.97?1 大劑量組125.05.96±1.38?25.08±1.36?115.06±3.10?1

與模型對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.01，*2P<0.05