ε-聚賴氨酸生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究

ε-聚賴氨酸（簡稱ε-PL）是由25～35個L-賴氨酸以α-COOH和ε-NH2相互脫水縮合而形成的一種同型氨基酸聚合物，主要由小白鏈霉菌經(jīng)液態(tài)好氧發(fā)酵分泌產(chǎn)生。目前，ε-PL主要作為一種天然食品防腐劑，在日本、韓國、美國和中國等國家的食品工業(yè)中應(yīng)用。由于它在抑菌譜、適用pH范圍、水溶性和穩(wěn)定性等方面，能夠與乳酸鏈球菌素和納他霉素等其他天然食品防腐劑形成有效互補(bǔ)，被認(rèn)為是推動天然食品防腐劑替代化學(xué)食品防腐劑的關(guān)鍵品種。

近年來，以江南大學(xué)為主的高校及研究機(jī)構(gòu)對ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了深入的研究。鄭根成等（2016）借助基因組重排和核糖體工程兩種育種手段強(qiáng)化ε-PL產(chǎn)生菌的合成能力，并利用pH沖擊工藝評價不同碳源對ε-PL發(fā)酵的影響。趙俊杰等（2019）利用抗性篩選和基因組重排技術(shù)對S.albulusMZ18進(jìn)行菌種選育以獲得高產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌株。通過引入巴龍霉素抗性到S.albulusM-Z18中，獲得兩株性狀優(yōu)良的菌株S.albulusP-1和S.albulusP-2，ε-聚賴氨酸產(chǎn)量分別為2.20 g/L和2.16 g/L；運用正交實驗優(yōu)化實驗條件，最終獲得一株高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的融合子S.albulusG12，產(chǎn)量為2.73 g/L，相比M-Z18提高了70.63%。孫啟星等（2015）為了解決ε-聚賴氨酸(ε-PL)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中后期ε-PL產(chǎn)率下降的問題，提出了在補(bǔ)料階段利用調(diào)節(jié)pH值和流加有機(jī)氮源(酵母粉)兩種手段來提高ε-PL產(chǎn)率，實現(xiàn)ε-PL平均產(chǎn)率分別達(dá)到4.62 g/(L·d)和5.16 g/(L·d)，較未調(diào)控補(bǔ)料分批發(fā)酵 (典型補(bǔ)料分批發(fā)酵)分別提高了27.3%和42.15%；同時，實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量分別達(dá)到36.95 g/L和41.32 g/L，較未調(diào)控補(bǔ)料分批發(fā)酵分別提高了27.4%和42.48%。進(jìn)一步細(xì)胞活性染色和關(guān)鍵酶活性分析發(fā)現(xiàn)，兩種策略均能顯著提高細(xì)胞活力和關(guān)鍵酶活性。李芳良（2017）以ε-PL分離和提取為研究對象，研究了ε-PL后提取試生產(chǎn)中涉及到膜分離工序的設(shè)備選型和工藝參數(shù)選擇，探討了利用超濾技術(shù)對試生產(chǎn)中出現(xiàn)的雜質(zhì)的有效去除，并初步提出了基于兩級超濾的ε-PL提取新工藝，實現(xiàn)ε-PL收率達(dá)到70.22%，純度為99.13%。中國專利CN201510021744.6公開了一種低pH值脅迫提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的方法，在發(fā)酵過程中引入酸性pH脅迫工藝，即人為或自發(fā)使pH降為2.5～3.0，維持12～48 h之后，將pH再提高到3.5～4.5，保持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。采用此種pH調(diào)控方法，能夠顯著提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的比生長速率和ε-聚賴氨酸比合成速率；結(jié)合補(bǔ)料-分批發(fā)酵方式，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量較普通兩階段pH調(diào)控工藝提高50%以上。CN201811117709.4公開一種pH響應(yīng)的ε-聚賴氨酸及其制備方法和應(yīng)用，所述pH響應(yīng)的ε-聚賴氨酸在ε-聚賴氨酸鏈上修飾有pH響應(yīng)小分子，pH響應(yīng)小分子具有微酸響應(yīng)性，不僅可以使ε-聚賴氨酸在細(xì)菌感染部位的微酸環(huán)境中起到殺菌作用，又能降低抗菌肽對生理環(huán)境中哺乳動物細(xì)胞的毒性作用，具有很高的選擇性。CN201810873130.4提供一種采用細(xì)胞固定化和離位、間歇吸附分離ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，以絲瓜絡(luò)或海綿作為細(xì)胞固定載體，安裝固定于發(fā)酵罐內(nèi)攪拌子、軸及檔板，隨后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入液體種子。發(fā)酵過程細(xì)胞吸附至固定化載體，實現(xiàn)細(xì)胞固定化；在ε-聚賴氨酸合成階段間歇流加滅過菌的有機(jī)氮源溶液；當(dāng)發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸積累至3.0 g/L時，采用離子交換樹脂離位分離ε-聚賴氨酸，當(dāng)發(fā)酵液重新積累至3.0 g/L時重復(fù)分離過程。該發(fā)明采用細(xì)胞固定化和離位分離技術(shù)相結(jié)合用于ε-聚賴氨酸發(fā)酵，并結(jié)合有機(jī)氮源間歇流加，可有效促進(jìn)細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成以及延長合成期，顯著提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量，具有實際應(yīng)用推廣前景。

ε-PL在市場上的需求量日益增加，但目前國內(nèi)的工業(yè)化水平仍較低，必須通過菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、提取的全鏈條技術(shù)創(chuàng)新，大幅降低ε-PL生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品得率和品質(zhì)。