檸檬酸發(fā)酵制備關(guān)鍵技術(shù)研究

檸檬酸易溶于水，無毒，無臭，具有很強(qiáng)的酸味，是全球產(chǎn)量最大的食品酸味劑，主要通過黑曲霉液體深層發(fā)酵制備。作為生物體代謝的主要產(chǎn)物之一，檸檬酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。檸檬酸發(fā)酵制備過程主要存在原料利用率差、菌種代謝調(diào)控機(jī)制不清楚、發(fā)酵過程自動(dòng)化程度低以及提取精制工藝污染嚴(yán)重等問題。

近年來，國內(nèi)外研究人員圍繞檸檬酸發(fā)酵原料水解、菌種代謝調(diào)控、發(fā)酵過程控制、提取精制工藝等關(guān)鍵技術(shù)難題開展了深入研究。Andersen Mikael R.（2011）對(duì)產(chǎn)酸的黑曲霉野生型菌株ATCC1015進(jìn)行了全基因組測序，并使用代謝物性能分析和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)對(duì)物種的高變異進(jìn)行確認(rèn)，轉(zhuǎn)錄組分析支持了與氨基酸合成相關(guān)的基因的上調(diào)。Ali S.(2005)研究了低pH值對(duì)黑曲霉菌株SK-17連續(xù)生產(chǎn)檸檬酸的影響。在15 L總?cè)萘康牟讳P鋼攪拌生物反應(yīng)器中進(jìn)行了微生物培養(yǎng)。以纖維素為原料，研究了低pH條件下葡萄糖對(duì)檸檬酸的生物轉(zhuǎn)化。蔗糖溶液通過垂直織物支撐的毛細(xì)管流動(dòng)添加，在界面上氧化為檸檬酸。同時(shí)優(yōu)化了溫度、濕度、氣流和葡萄糖給料率的條件。中國專利CN201710022534.8公開了一種提高黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)量的方法，其將黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脫氫酶SSD基因整合到黑曲霉基因組上得到重組黑曲霉菌株，利用重組黑曲霉菌株發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸；琥珀酸半醛脫氫酶SSD基因的表達(dá)受Pgas啟動(dòng)子的調(diào)控。該方法實(shí)現(xiàn)了琥珀酸半醛脫氫酶SSD在黑曲霉中的表達(dá)，以增強(qiáng)GABA通路，從而加強(qiáng)TCA循環(huán)，促進(jìn)檸檬酸的合成。 CN201711293931.5公開了一種黑曲霉種子培養(yǎng)及其制備檸檬酸的方法，所述方法包括如下步驟：(1)取培養(yǎng)成熟的黑曲霉麩曲孢子，得到分散孢子懸液；(2)培養(yǎng)步驟(1)中的分散孢子懸液，得到發(fā)芽孢子；(3)發(fā)芽孢子重新分散，種子罐內(nèi)培養(yǎng)，得到成熟種子液；(4)成熟種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)發(fā)酵，得到檸檬酸發(fā)酵液。該發(fā)明解決了孢子萌發(fā)過程中聚集的問題，提高孢子成球率，增加菌絲球數(shù)量，有效控制菌絲球的大小均一性，提高菌體的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵周期縮短。CN201611236665.8涉及一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：構(gòu)建HGT1蛋白表達(dá)框，HGT1蛋白表達(dá)框內(nèi)包含組成型啟動(dòng)子、與組成型啟動(dòng)子連接的HGT1蛋白編碼基因以及與HGT1蛋白編碼基因連接的終止子；構(gòu)建抗性基因表達(dá)框，抗性基因表達(dá)框內(nèi)包含組成型啟動(dòng)子、與組成型啟動(dòng)子連接的hph基因以及與hph基因連接的終止子；將HGT1蛋白表達(dá)框和抗性基因表達(dá)框轉(zhuǎn)化到霉菌中，得到重組霉菌。該發(fā)明通過啟動(dòng)高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，進(jìn)而提高霉菌中檸檬酸的產(chǎn)量，且發(fā)酵時(shí)間大大縮短。CN201010506932.5公開了基于檸檬酸代謝網(wǎng)絡(luò)的體積溶氧傳遞系數(shù)分階段控制方法，通過控制檸檬酸不同發(fā)酵階段的溶解氧來控制代謝的流向從而提高檸檬酸的產(chǎn)量。CN201711432103.5涉及一種提高檸檬酸發(fā)酵中糖利用率和檸檬酸酸產(chǎn)量的方法及應(yīng)用，該方法是通過敲除生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，構(gòu)建基因工程菌，并將其用于檸檬酸發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的敲除可以使還原糖含量降低8.96%～9.89%，總糖含量降低9.78%～10.26%，異麥芽糖含量降低6.12%～7.01%，檸檬酸產(chǎn)量提高10.28%～12.16%，一年可以減少殘?zhí)侵辽偌s1.5萬t。CN201710992518.1涉及一種檸檬酸發(fā)酵菌絲體水解液回用于檸檬酸發(fā)酵的方法，以檸檬酸發(fā)酵后的廢棄黑曲霉菌絲體為原料，添加合理氮源與碳源進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，既能有效的提高黑曲霉菌絲體的利用價(jià)值，又能提高檸檬酸發(fā)酵過程菌種利用氮源的效率，促進(jìn)檸檬酸快速生長和產(chǎn)酸，減少能源消耗，提高產(chǎn)酸效率。CN201810465046.9涉及一種縮短檸檬酸發(fā)酵周期的方法。該方法是在檸檬酸發(fā)酵過程中，在發(fā)酵罐培養(yǎng)環(huán)節(jié)加入1‰～2.5‰的非離子表面活性劑，改善了黑曲霉細(xì)胞膜的通透性，有利于營養(yǎng)物質(zhì)快速進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，加快細(xì)胞代謝；同時(shí)提高氧的傳質(zhì)，降低空氣消耗，使發(fā)酵周期大大縮短，提高生產(chǎn)效率，增加產(chǎn)能。

以生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和自動(dòng)控制理論為基礎(chǔ)的現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)的快速發(fā)展，為檸檬酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化與發(fā)展提供了技術(shù)導(dǎo)向。研究人員應(yīng)該致力于對(duì)檸檬酸發(fā)酵工藝進(jìn)行全流程重構(gòu)和系統(tǒng)創(chuàng)新，創(chuàng)制新一代檸檬酸發(fā)酵制備關(guān)鍵技術(shù)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)升級(jí)和可持續(xù)發(fā)展。