p44/WDR77基因與細(xì)胞周期蛋白D3在非小細(xì)胞肺癌中的表達及相關(guān)性研究*

崔淵博 張志培 景鵬宇 王雪嬌 王武平 李維妙 谷仲平

肺癌是對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。在我國，每年約有70萬人死于肺癌，其中80%以上的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[3-4]。作為原發(fā)性肺癌的主要病理類型，NSCLC對目前的放化療方案敏感性較差，手術(shù)治療難以達到根治效果，致使患者的5年生存率仍低于20%[5-6]。肺癌的發(fā)生機制是個復(fù)雜的過程，而細(xì)胞周期失調(diào)正是腫瘤細(xì)胞的基本特性。目前的研究表明，細(xì)胞周期蛋白D3(Cyclin D3)作為Cyclin D的亞型之一，能促進G1/S期的轉(zhuǎn)換，在腫瘤細(xì)胞的生長與增殖中扮演著關(guān)鍵角色[7]。

雄激素受體輔助因子(44-KDa androgen receptor cofactor/WD repeat domain 77，p44/WDR77)是新發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤相關(guān)基因，其同樣作用于細(xì)胞周期G1期，促進細(xì)胞增殖，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。目前，有關(guān)p44/WDR77在NSCLC中的表達、與Cyclin D3表達的相關(guān)性以及對NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響和作用研究較少。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)法對NSCLC標(biāo)本中p44/WDR77與Cyclin D3的表達情況進行檢測，分析二者表達的相關(guān)性以及其與NSCLC臨床及病理特征的關(guān)系，為NSCLC患者的診斷及防治提供有價值的檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2006年3月至2011年9月第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的190例原發(fā)性NSCLC患者的腫瘤組織配對標(biāo)本，正常組織取自癌旁5 cm以上且病理檢查為正常形態(tài)的肺組織。190例原發(fā)性NSCLC患者中男性145例，女性45例；年齡30～80歲，平均年齡(61±16.8)歲。所有病例均有完整的臨床及病理資料，術(shù)前均未接受放化療或生物學(xué)等抗癌治療。配對標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定、脫水及透明，常規(guī)石蠟包埋。組織病理分型、分級由病理科診斷。本研究所用標(biāo)本的使用均征得了第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意，且患者本人或家屬知情。

1.2 檢測試劑

p44/WDR77抗體為兔抗人多克隆抗體(Gu等[9]預(yù)先純化、克隆而成)；Cyclin D3蛋白抗體為Cell Signaling商品化鼠源性抗體(購自丹麥DAKO產(chǎn)品)；EnVisionTM免疫組織化學(xué)試劑盒購自丹麥DAKO產(chǎn)品；DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。

1.3 操作步驟

標(biāo)本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，分別做HE和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色采用兩步法(EnVisionTM)。

(1)切片脫蠟至水后尿素消化，3%過氧化氫封閉，用檸檬酸緩沖液進行微波修復(fù)、冷卻，10%羊血清封閉，加一抗4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫，加入抗兔二抗(EnVisionTM)，37 ℃恒溫反應(yīng)，中間各步使用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，DAB顯色，顯微鏡觀察終止顯色。

(2)蘇木素輕微復(fù)染，脫水透明封片，光鏡下觀察。對照組設(shè)陽性、陰性和空白對照：用已知陽性表達組織作為陽性對照；以PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判讀

所有切片均經(jīng)2位資深病理醫(yī)師采用盲法閱片。按照半定量積分方法判定，每例均隨機觀察5個高倍視野(×400)。

判斷結(jié)果：①陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將細(xì)胞陽性率與染色強度積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對免疫組織化學(xué)結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，p44/WDR77、Cyclin D3在NSCLC組織和正常組織中表達的差異性用Wilcoxon(W)檢驗；兩組間采用Mann-Whitney U秩和檢驗，3組以上采用Kruskal-Wallis H檢驗；兩者表達的相互關(guān)系用Spearman秩相關(guān)檢驗，以r表示秩相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p44/WDR77和Cyclin D3的定位及其在NSCLC組織與正常組織中的表達

(1)p44/WDR77和CyclinD3均定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，NSCLC組織中高表達(如圖1所示)。

圖1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表達(免疫組織學(xué)化Envision法)

(2)p44/WDR77和Cyclin D3的總陽性率分別為82.63%(157/190)和86.32%(164/190)，相應(yīng)病例正常組織陽性率分別為11.05%(21/190)和5.79%(11/190)；p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌、鱗癌中的陽性率分別為83.33%(60/72)、82.20%(97/118)、91.67%(66/72)及83.05%(98/118)，相應(yīng)病例正常組織陽性率分別為9.72%(7/72)、11.86%(14/118)、2.78%(2/72)及7.63%(9/118)。p44/WDR77在NSCLC、腺癌、鱗癌組織與相應(yīng)正常組織中的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=11.379，Z=7.000，Z=9.459；P＜0.05)。Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鱗癌組織與相應(yīng)正常組織中的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=11.386，Z=7.225，Z=8.827；P＜0.05)。

2.2 NSCLC臨床特征與p44/WDR77及Cyclin D3的表達

p44/WDR77的表達與患者年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.614，P＜0.05)，而與患者的性別無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.545，P＞0.05)；Cyclin D3的表達與患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.265，Z=-0.870；P＞0.05)，見表1。

2.3 NSCLC組織病理分型、分級間p44/WDR77及Cyclin D3的表達

p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌與鱗癌間表達均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.777，Z=-1.252；P＞0.05)；但在NSCLC組織不同病理分級間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=17.077，x2=6.233；P＜0.05)，其中腺癌、鱗癌組織不同病理分級與p44/WDR77表達相關(guān)(x2=7.051，x2=10.184；P＜0.05)，而與Cyclin D3表達均無相關(guān)性(x2=3.277，x2=5.081；P＞0.05)，見表2、表3。

2.4 NSCLC的TNM分期與p44/WDR77、Cyclin D3的表達

p44/WDR77及Cyclin D3在NSCLC不同TNM分期間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=11.842，x2=10.273；P＜0.05)，見表3。

表1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同年齡及性別中表達的差異性(例)

表2 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理類型中表達的比較(例)

表3 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理類型中表達的比較(例)

表4 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC是否淋巴轉(zhuǎn)移患者分組中表達的比較(例)

表5 p44/WDR77 和Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鱗癌中表達的相關(guān)性(例)

2.5 NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與p44/WDR77、Cyclin D3的表達差異性

在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中，Cyclin D3陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.103，P=0.035)；而p44/WDR77表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否間的患者中表達差異無有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.488，P=0.626)，見表4。

2.6 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC組織中蛋白表達相關(guān)性檢驗

經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗，在NSCLC、腺癌及鱗癌組織中p44/WDR77和Cyclin D3蛋白表達秩相關(guān)性在鱗癌、NSCLC組織中呈正相關(guān)(r=0.231，r=0.156，r=0.283；P＜0.05)，見表5。

3 討論

p44/WDR77是一個與雄激素受體相互作用的蛋白，因其相對分子質(zhì)量為44×103，且含有間隔77個氨基酸重復(fù)出現(xiàn)色氨酸和天門冬氨酸結(jié)構(gòu)，故將其命名為p44/WDR77[10]。最近的研究證實，其作用于細(xì)胞周期G1期，對細(xì)胞增殖、分化過程具有促進作用，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著十分重要的角色[11-13]。同樣對G1期調(diào)控及啟動DNA合成有重要作用的Cyclin D3在卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤[14-15]中存在異常表達情況，但在NSCLC中的研究相對較少。Gu等[9]在對p44/WDR77影響細(xì)胞周期進程的研究中發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)p44/WDR77的表達，同時檢測與G1期到S期過渡有關(guān)的9種調(diào)控因子，其中Cyclin D1的表達明顯降低?；谝炎C實的結(jié)論，本研究推測與Cyclin D1具有相似結(jié)構(gòu)的Cyclin D3，在調(diào)控細(xì)胞周期時同樣受到p44/WDR77表達影響，最終促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對190例NSCLC患者樣本中p44/WDR77及Cyclin D3蛋白表達進行檢測。結(jié)果顯示，p44/WDR77和Cyclin D3經(jīng)分別分析比較，二者均在NSCLC、腺癌及鱗癌組織的表達率明顯高于正常組織，差異極其顯著；但在腺癌及鱗癌間p44/WDR77和Cyclin D3表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表達無癌組織種類差異性，但是與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)，為NSCLC的差異蛋白。

有研究報道，p44/WDR77表達不僅促進成長階段小鼠的前列腺上皮分化[8，12]而且與老齡階段的小鼠發(fā)生前列腺癌變有一定關(guān)系[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年NSCLC患者(＞60歲)的p44/WDR77表達率明顯高于中青年患者(≤60歲)，且差異顯著；同時，p44/WDR77的表達強度與NSCLC的組織分化程度、TNM分期密切相關(guān)；其中，p44/WDR77在不同分化的鱗癌組織中差異同樣顯著。呈現(xiàn)出p44/WDR77在NSCLC組織低分化比高分化表達強度高、TNM分期高的比分期低的有高表達的趨勢，其與Gu等[9]研究結(jié)果一致，即p44/WDR77表達水平隨小鼠肺上皮細(xì)胞分化成熟而降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D3作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白，其表達率與患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但實驗證實Cyclin D3的表達與NSCLC組織病理分級、TNM分期密切相關(guān)，而且表達強度趨勢與p44/WDR77一致。眾所周知，癌組織分化程度和TNM分期反映了疾病的侵襲性和進展程度，由此表明，在NSCLC細(xì)胞的生長、增殖及細(xì)胞的侵襲中，p44/WDR77與Cyclin D3表達起重要作用。此外，本研究提示，Cyclin D3高表達可能促進NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而p44/WDR77表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)論，本研究推測p44/WDR77表達存在促使NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。

本研究對p44/WDR77與Cyclin D3表達進行了Spearman相關(guān)性檢驗顯示，無論是NSCLC總體樣本，還是肺鱗癌中，兩種蛋白表達均呈正相關(guān)。表明p44/WDR77與Cyclin D3在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程可能起著協(xié)同作用，共同促進癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移。

p44/WDR77和Cyclin D3是NSCLC組織與相應(yīng)正常組織表達的差異蛋白；二者表達的高低與細(xì)胞分化程度的高低、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否相關(guān)。但是目前關(guān)于p44/WDR77及Cyclin D3蛋白相互作用機制尚無確切報道，通過文獻資料結(jié)合本研究結(jié)果，推測p44/WDR77過表達可能上調(diào)Cyclin D3的表達，繼而導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，促進NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲。然而，這一結(jié)論仍需通過體內(nèi)外實驗研究驗證，今后將擴大樣本量，對此進行后續(xù)的前瞻性研究。