五重實時熒光PCR檢測方法的建立分析

關(guān) 偉

（黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)新利街道辦事處，哈爾濱 150302）

針對狐貍、水貂、貉子和狗源性成分進行具體的分析，并針對其特異性引物以及探針進行相應(yīng)的研究，從而針對其自身的體質(zhì)來進行相應(yīng)的產(chǎn)品進行挑選，為了更好的檢測狐貍、水貂、貉子和狗針對熒光PCR 反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件來進行相應(yīng)的篩選，從而更好地突出狐貍、水貂、貉子和狗各自的特異性，選擇與自身屬性相符的產(chǎn)品來進行相應(yīng)的實時熒光PCR檢測。

1 應(yīng)用的材料以及方法

1.1 所需材料

文章中接受檢查的材料都是來自山東的養(yǎng)殖場的，其中一些動物的生肉以及部分五谷都是源于濟南市的農(nóng)貿(mào)市場，而飼料肉骨粉所需要的一些材料大部分都是從一些生產(chǎn)廠家選取的。

1.2 所需儀器和試劑

針對動物提取組織的試劑盒品牌要進行嚴(yán)格的挑選，文章中進行的實驗主要使用OMEGA 品牌，一些PCR 反應(yīng)試劑主要從大連的寶生物工程有限公司，引物和探針主要從上海的生工生物工程有限公司進行負(fù)責(zé)，針對動物的DNA 測序主要由山東省農(nóng)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心的測序中心進行相關(guān)的負(fù)責(zé)事宜，至于一些熒光定量PCR 儀以及高速離心機都由相應(yīng)的品牌公司產(chǎn)品進行相應(yīng)的負(fù)責(zé)。

1.3 制定的方案

引物與探針的設(shè)計，通過對動物進行的rRNA的基因序列進行相應(yīng)的調(diào)查，從而通過相應(yīng)軟件進行同源性的對比，根據(jù)篩選出來的核心片段來進行相應(yīng)通用引物的設(shè)計，從而更好地將引物與探針的特異性展現(xiàn)出來，通過不同的發(fā)光基團來進行相應(yīng)的修飾，來清晰實驗效果

針對陽性擴增內(nèi)標(biāo)DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建，通過相應(yīng)的DNA 生成工具來進行相應(yīng)的DNA 序列生成，再將其與4種犬科動物源性擴增引物序列進行連接，從而形成新的DNA序列，通過這些擴增的引物序列來進行質(zhì)粒提取，從而針對重組質(zhì)粒進行相應(yīng)的檢測驗證，從而達(dá)到結(jié)果與目的的片段得到更好地融合一致；就是針對樣品的DNA提取，在將樣本充分研磨之后針對試劑進行DNA的提取，提取的方法可以借助儀器動物組織提取試劑盒來進行相應(yīng)的提取工程，也可以通過經(jīng)典手提法來進行相應(yīng)的DNA提取，其中參照了分子克隆手冊動物組織DNA的提取手法，在利用核酸檢測儀進行檢測的時候針對DNA 的濃度以及OD 值都具備一定的要求；主要是目的基因的擴增及標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建，針對在狐貍、水貂、貉子和狗身上提取的引物進行相應(yīng)的PCR 擴增，之后再根據(jù)條件進行相應(yīng)的步驟，將其動物源性PCR 產(chǎn)物進行切膠回收之后可以將這個轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中進行過夜培養(yǎng)，隨后挑取單克隆，利用PCR 酶來對克隆子進行相應(yīng)的性質(zhì)檢測和驗證，從而針對對克隆子的測序來對狐貍、水貂、貉子和狗源性成分進行相應(yīng)確認(rèn)。

多重?zé)晒釶CR 檢測方法的建立，通過針對動物進行的熒光定量PCR 反應(yīng)體系進行相應(yīng)的完善，從而更好地建立動物相對獨立的單重?zé)晒舛縋CR 檢測方法，在進行PCR反應(yīng)檢測過程中要嚴(yán)格的根據(jù)針對動物的特異性以及實驗過程應(yīng)該注意的事項進行相應(yīng)的嚴(yán)格執(zhí)行。在進行多重實時熒光PCR 檢測時需要在單一熒光PCR 建立最優(yōu)體系以及試驗特異性及穩(wěn)定性得到相應(yīng)保障的情況下進行，才能更好的動物的通用引物、特異探針、內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒DNA以及陽性內(nèi)標(biāo)探針進行相應(yīng)的測試。再根據(jù)實驗參數(shù)進行相應(yīng)的實驗優(yōu)化。

多重實時熒光PCR 特異性測試，提取從濟南農(nóng)貿(mào)市場采購材料的基因組DNA作為模板，根據(jù)優(yōu)化之后的反應(yīng)體系以及條件來進行相應(yīng)的熒光定量PCR 檢測其中的引物以及探針特異性。

多重實時熒光PCR 靈敏度實驗，利用動物組織提取試劑盒來針對動物的基因組DNA進行相應(yīng)的提取，再稀釋到優(yōu)化以后的濃度，從而更好地檢測動物的DNA濃度模板以及靈敏度；主要針對飼料肉骨粉所需要的材料進行相應(yīng)的檢測，從而更好地實現(xiàn)重新建立的多重實時熒光PCR 檢測方法以及樣品的價值。

2 實驗結(jié)果

針對實驗可以得知通過引用單一動物PCR 擴增結(jié)果及單重?zé)晒釶CR 檢測方法的建立；針對多重?zé)晒釶CR 檢測方法的建立，主要針對動物源性中的引物濃度進行相應(yīng)的信號提示；多重?zé)晒釶CR 特異性實驗，更好地針對動物的引物以及探針進行相應(yīng)的特異性檢測，從而針對動物體內(nèi)的指標(biāo)進行熒光檢測；多重?zé)晒釶CR 靈敏度的實驗主要通過提取動物DNA來進行相應(yīng)的檢測，從而考查引物以及探針的靈敏度；最后就是針對樣品的檢測，通過針對樣品進行檢測從而有效針對動物源性成分更好地進行檢測。

3 小 結(jié)

近幾年，經(jīng)常會出現(xiàn)飼料原料以及添加劑受到污染的情況，從而導(dǎo)致動物自身也受到一定的影響，威脅到了人們自身的權(quán)益，所以人們針對飼料以及肉骨粉來進行了嚴(yán)格的監(jiān)督，同時也通過研究來針對動物自身進行相應(yīng)的檢測，從而達(dá)到動物更加健康的生長，間接減少社會危機問題的浮現(xiàn)。